Notre protocole peut être utilisé pour produire des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes de haute qualité à partir de cellules souches embryonnaires qui expriment le facteur de stimulation immunitaire, GM-CSF. Les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes porteuses de GM-CSF ont le potentiel de servir de vésicules régulatrices immunitaires sans cellules qui peuvent moduler la réponse immunitaire. Les chercheurs ayant une formation de base en biologie moléculaire et cellulaire devraient être en mesure de suivre facilement ce protocole, mais toute personne effectuant ce protocole pour la première fois devrait suivre les instructions de près.
Comme notre protocole est compliqué, visualiser les détails complexes de chaque étape aidera d’autres chercheurs à générer des FBS sans exosomes, à ultracentrifuger le volume souhaité de FBS et à collecter le surnageant libre d’exosomes. Avant de plaquer les trois cellules ESD, recouvrir les boîtes de culture tissulaire de 15 centimètres de 0,1% de gélatine à température ambiante pendant 30 minutes. Retirer la gélatine par aspiration et culture les trois cellules ESD sans cellules de la couche nourricière dans un milieu de culture à trois cellules ESD à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié au dioxyde de carbone à 5% jusqu’à ce que les cellules atteignent 90% de confluence.
Laver les cultures presque confluentes avec cinq millilitres de trypsine à 0,05% par plat, suivis d’une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius dans de la trypsine fraîche. À la fin de l’incubation, tirez les cellules détachées dans un tube de centrifugeuse et inactivez la trypsine avec cinq millilitres de milieu de culture frais. Sédimenter les cellules par centrifugation et re-suspendre les palettes dans un milieu frais pour le comptage Pour le passage, plaque cinq fois 10 à la sixième de l’ESD trois cellules dans 15 millilitres de milieu de culture cellulaire sur de nouvelles plaques enduites de gélatine pendant trois jours de culture avant de sous-cultiver les cellules Pour collecter le surnageant de culture cellulaire pour l’isolement des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes plaque une fois 10 à la septième ESD trois cellules sur 15 millilitres de milieu de culture cellulaire par nouvelle plaque revêtue de gélatine pendant trois jours avant la collecte des surnageants de culture cellulaire Pour l’isolement des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes, d’abord sédimenter les gros fragments cellulaires dans les surnageants collectés à partir de trois cellules ESD cultivées pendant 72 heures par centrifugation.
Après avoir recueilli le surnageant, Ultracentrifuge les échantillons et jeter les surnageants. Rincez doucement chaque palette deux fois avec un millilitre de PBS par lavage pour éliminer tout surnageant de culture résiduel et quantifier la teneur en protéines de vésicules extracellulaires enrichies en exosomes avec un test d’acide bicinchoninique, selon les instructions du fabricant. Ensuite, re-suspendez les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes dans le PBS à une concentration de six microgrammes par micromètre pour un stockage à moins 80 degrés Celsius.
Pour visualiser les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes par microscopie électronique à transmission, fixez trois à cinq microgrammes par millilitre des vésicules extracellulaires avec la concentration finale de paraformaldéhyde de grille de microscope électronique à 2% à température ambiante pendant deux heures. À la fin de l’incubation, chargez 10 microlitres des échantillons fixes sur des grilles de cuivre avec un film de support en carbone pendant une minute avant de vider les grilles avec du papier filtre, restez dans les grilles avec une solution de coloration appropriée, conformément au protocole du fabricant et utilisez une pince à épiler pour transférer les grilles sur un morceau de papier filtre, puis utilisez le microscope électronique à transmission avec un grossissement de 50 000 fois pour acquérir des images de microscopie électronique, selon les protocoles standard. Pour préparer des extraits de cellules entières, prélevez trois cellules ESD de la culture comme démontré, et re-suspendez les cellules récoltées dans PBS pour le comptage.
Après une deuxième centrifugation, re-suspendre les cellules de cinq fois 10 à la troisième cellule par microlitre de tampon de chargement de page SDS contenant une concentration de 0,5% de SDS et Sonicate les échantillons pendant 10 secondes sur un Sonicator avec une amplitude de 10%. Ensuite, chauffez les échantillons à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour préparer les lysates pour les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes, re-suspendez les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes dans un tampon de chargement de page SDS contenant 0,5% de FDS à une concentration de 1,2 microgramme par microlitre et Sonicate les échantillons pendant 10 secondes comme démontré, puis chauffez les échantillons à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Pour l’analyse Western Blot, chargez 10 microlitres d’extrait en gros et d’échantillons de lysate de vésicules extracellulaires enrichis en exosomes dans des puits individuels d’un meilleur gel de page de stress. À la fin de l’exécution, transférez les protéines sur des membranes PVDF et incubez les membranes avec les anticorps primaires et secondaires appropriés d’intérêt, puis détectez l’expression des protéines à l’aide d’un kit de détection de chimiluminescence amélioré, selon les instructions du fabricant. Pour évaluer la quantité de GM-CSF dans les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes, utilisez un kit Murine GM-CSF pour recouvrir une plaque ELISA d’anticorps anti-GM-CSF capture ensuite, traiter 0,6 microgrammes d’échantillons de vésicules extracellulaires enrichies en exosomes avec 100 microlitres de PBS seul, ou PBS plus 0,05% interpolation 20 à température ambiante pendant 30 minutes.
À la fin de l’incubation, ajouter les échantillons traités aux puits individuels de la plaque ELISA préparée pour une incubation d’une heure à température ambiante suivie du lavage des puits correspondants appropriés avec PBS seul, ou PBS plus 0,05% tween 20. Après le lavage, ajouter l’anticorps de détection aux échantillons pour une incubation d’une heure à température ambiante suivie d’un lavage avec DU PBS seul ou du PBS plus 0,05% entre 20 comme démontré, Puis ajouter la peroxydase de raifort Avidin aux échantillons pour une incubation de 30 minutes à température ambiante, suivie d’un lavage et de la mesure de l’absorbance dans chaque puits sur un lecteur de microplaques à 450 nanomètres. L’intensité de fluorescence GFP d’un GM-CSF exprimant une lignée cellulaire ESD trois ou d’une lignée ESD trois cellules exprimant un vecteur vide est beaucoup plus élevée que celle de leurs homologues parentaux.
ELISA révèle que trois cellules EXPRIMANT GM-CSF produisent des niveaux nettement plus élevés de GMCSF dans leur surnageant de culture cellulaire que les cellules de contrôle vectoriel vides. En outre, la quantité de GM-CSF générée par GM-CSF exprimant trois cellules ESD est similaire à celle produite par les fibroblastes STO exprimant GM-CSF. La microscopie électronique à transmission de vésicules extracellulaires isolées à partir de cultures cellulaires transduies vectorielles et transduies par GM-CSF révèle des vésicules de différentes tailles qui se situent dans la plage de diamètre attendue de 30 à 100 nanomètres.
L’expression des marqueurs exosomaux, y compris CD81, Annexine V et flottilline-1, est nettement améliorée dans les vésicules extracellulaires, isolées à partir de trois cellules ESD par rapport aux extraits de gros correspondants par analyse par transfert Western. Il est important de noter que la présence d’autres marqueurs de compartiments subcellulaires dans trois vésicules extracellulaires dérivées d’ESD n’a pas été détectée, y compris le marqueur de réticulum endoplasmique, l’isomérase de disulfure de protéine, les marqueurs mitochondriaux, le cytochrome C et le complexe Oxphos IV-sous-unité IV et le marqueur cytosolique GAPDH. Après lavage à 0,05% entre 20, les niveaux de GM-CSF de fond détectés dans les vésicules extracellulaires témoins ont été considérablement réduits.
En revanche, les niveaux de GM-CSF dans les vésicules extracellulaires des cellules exprimant gm-CSF ont été significativement augmentés entre 20. L’acquisition de vésicules extracellulaires enrichies en exosomes de haute qualité portant GMCSF est l’étape la plus importante pour le succès de ce protocole. Les chercheurs peuvent effectuer des expériences supplémentaires, telles que des études sur des lignées cellulaires et des animaux dépendants du GM-CSF pour déterminer si les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes soignant le GM-CSF peuvent fonctionner comme des vésicules régulatrices immunitaires sans cellules.
Ces vésicules extracellulaires enrichies en exosomes peuvent ensuite être utilisées pour explorer comment la modulation de la réponse immunitaire affecte différentes maladies.
