Il s’agit d’un protocole simple et efficace pour isoler et concentrer de petites vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses. Cette technique est facile à adopter dans la plupart des laboratoires car il s’agit d’une échelle de paillasse et ne nécessite que des instruments simples pour les opérations. Pour isoler une des petites vésicules extracellulaires, nous recommandons de cultiver des cellules à grande échelle pour obtenir un minimum de cent millions de cellules.
Bien que cela semble simple, certaines étapes critiques de cette technique sont mieux informées par une démonstration visuelle. Nous espérons que les chercheurs pourront apprendre de notre expérience et maîtriser les compétences en toute confiance. Notre doctorant, M. Chan, Hong Hao, vous guidera à travers notre expérience dans l’isolement et la caractérisation de petites vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses.
Pour commencer, centrifuger le milieu conditionné à 200g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Recueillir et filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,22 micromètre pour éliminer les particules de plus de 220 nanomètres. Rempli une unité de filtration centrifuge avec 30 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate filtrée de 0,2 micromètre.
Ensuite, centrifuger l’unité de filtration centrifuge à 3, 500g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter la solution dans le gobelet de solution de filtrat. Ajouter 70 millilitres de milieu conditionné filtré dans l’unité de filtration centrifuge et centrifuger l’unité à 3, 500g à quatre degrés Celsius.
Jeter la solution dans le gobelet de solution de filtrat. Ajouter 30 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate filtrée et centrifuger l’unité à 3 500 g à quatre degrés Celsius. Installez une coupelle de collecte de concentré sur l’unité de filtration et inversez la centrifugeuse à 1 000 g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir les petites vésicules extracellulaires purifiées.
Filtrer les petites vésicules extracellulaires à travers un filtre à seringue de 0,22 micromètre. Transférer les échantillons dans de nouveaux tubes et les stocker à 80 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie. Pour commencer l’analyse de suivi des nanoparticules, diluez les cellules souches mésenchymateuses isolées du cordon ombilical humain de petites vésicules extracellulaires dans une solution saline filtrée tamponnée au phosphate à 20 à 100 particules par image.
Introduire un millilitre de l’échantillon dilué dans la chambre anti-A à l’aide de seringues jetables d’un millilitre. Réglez les paramètres de mesure en conséquence. Réglez le niveau de la caméra au niveau 14.
Pour chaque mesure, cliquez sur la mesure standard et réglez la dilution en conséquence. Ensuite, cliquez sur Capturer, démarrer la caméra et réglez le niveau de la caméra sur 14 pour visualiser les petits véhicules électriques. Pour lancer la mesure, cliquez sur Créer, puis sur Exécuter le script et sélectionnez l’emplacement où les fichiers doivent être enregistrés.
Saisissez les détails nécessaires de l’exemple et cliquez sur OK. Cliquez sur le paramètre OK pour continuer le script et cliquez sur OK pour lancer la mesure. Une fois la mesure enregistrée, analysez les résultats avec un seuil de détection de cinq pour inclure 10 à 100 croix rouges par image. Et le nombre de croix bleues est limité à cinq.
Cliquez sur Paramètre OK pour continuer le script et lancer l’analyse. Cliquez sur OK dans la notification de script terminé et exportez pour exporter les données vers l’emplacement défini. Lyser les cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain petites vésicules extracellulaires avec un tampon de lyse de dosage de radioimmunoprécipitation glacial et incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Recueillir le surnageant après centrifugation à 200g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Quantifier la protéine à l’aide d’un test BCA. Assemblez le jeu d’électrophorèse sur gel en conséquence et effectuez l’électrophorèse sur gel à 90 volts jusqu’à ce que la protéine atteigne l’extrémité du gel d’empilage.
Changez la tension à 200 volts pour séparer les protéines jusqu’à la fin du gel de résolution. Effectuer un transfert semi-sec pour transférer les protéines du gel à une membrane de difluorure de polyvinylidène à 15 volts pendant une heure. Bloquer la membrane PVDF avec 3% d’albumine sérique bovine dans une solution saline tamponnée au tris 0,1% Tween 20 pendant une heure sur un agitateur à température ambiante.
Incuber la membrane PVDF avec des anticorps primaires à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec des secousses constantes. Le lendemain, laver la membrane PVDF cinq fois et cinq minutes chacune avec TBST et incuber avec un anticorps secondaire pendant une heure en agitant à température ambiante. Encore une fois, lavez la membrane PVDF avec TBST cinq fois et visualisez la membrane dans un imageur à couplage de charge à l’aide d’un réactif de détection chimiluminescent.
Analysez le niveau d’expression des protéines à l’aide du logiciel ImageJ. Tout d’abord, ouvrez le fichier image dans ImageJ. Améliorez la qualité de l’image en ajustant la luminosité et le contraste.
Ajustez l’image jusqu’à ce que les taches soient clairement visibles. Cliquez sur le bouton Appliquer et enregistrez les images au format TIFF. Pour l’analyse au microscope électronique à transmission, diluer une partie du petit échantillon de vésicules extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain avec quatre parties de solution saline filtrée tamponnée au phosphate jusqu’à obtenir un volume total de 10 microlitres et incuber sur une grille de cuivre recouverte de carbone pendant 15 minutes.
Retirez l’échantillon excédentaire à l’aide d’une lingette de laboratoire et laissez-le sécher à l’air libre pendant trois minutes. Incuber 10 microlitres de solution d’acide phosphotungstique à 1% pour colorer l’échantillon pendant trois minutes. Retirez l’excès de solution d’acide phosphotungstique à 1 % à l’aide d’une lingette de laboratoire et laissez-la sécher à l’air libre pendant trois minutes pour obtenir une image au microscope électronique à transmission.
Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain Les petites vésicules extracellulaires ont un mode de taille de particules de 53 nanomètres, tandis que d’autres pics significatifs de taille de particules étaient de 96 et 115 nanomètres. La concentration de petites vésicules extracellulaires MSC dérivées du cordon ombilical humain mesurée par NTA était de 7,75 fois 10 à la 10ème particules par millilitre. La concentration en protéines des petites vésicules extracellulaires MSC dérivées du cordon ombilical humain mesurée avec le test BCA était d’environ 80 microgrammes par millilitre.
Dans l’analyse par transfert Western, les petites vésicules extracellulaires MSC dérivées du cordon ombilical humain ont montré des bandes positives pour les marqueurs exosomaux CD9, CD81 et TSG101, mais étaient négatives pour GRP94. Les petites vésicules extracellulaires MSC isolées dérivées du cordon ombilical humain ont été visualisées sous TEM pour déterminer leur taille et leur morphologie. Cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain petites vésicules extracellulaires d’environ 100 nanomètres et montrant une structure membranaire bicouche en forme de coupe.
Avec le développement réussi du protocole, nous pouvons maintenant découvrir le potentiel thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses dérivées de petites vésicules extracellulaires dans les médicaments régénératifs.
