Les cellules HC11 et EpH4 sont des lignées cellulaires épithéliales du sein de souris qui peuvent se différencier en culture. Dans le même temps, ces cellules peuvent être transformées par un certain nombre d’oncogènes. Ces cellules sont idéales pour l’étude de l’interrelation entre la différenciation et la transformation néoplastique.
Ces techniques peuvent être utilisées dans des études de transduction de signaux pour découvrir des cibles pour la thérapie contre le cancer. Par exemple, la petite GTPase Rac et d’autres molécules peuvent déclencher la transformation des cellules épithéliales du sein lorsqu’elles sont exprimées à des niveaux élevés, mais étonnamment à de faibles niveaux, elles peuvent induire une différenciation. D’autres transducteurs de signaux peuvent se comporter de la même manière.
Les principes peuvent également s’appliquer à d’autres types de différenciation lorsque la confluence cellulaire joue un rôle important, par exemple la différenciation des adipocytes ou des myotubes. Quelqu’un exécutant cette technique pour la première fois devrait garder à l’esprit que le placage des cellules HC11 est important. C’est parce que le contact cellule-cellule est important pour la différenciation.
Un autre point à surveiller est que l’extraction correcte des cellules EpH4 de la matrice est essentielle pour la quantitation des protéines, car tous les résidus affecteront la détermination des protéines. La démonstration visuelle de cette méthode est utile parce que certains détails du protocole sont difficiles à décrire sur papier. Commencez par préparer une bouteille de 50 millilitres de milieu cellulaire HC11 selon les directives manuscrites.
Pour plaquer les cellules, aspirer le milieu de cinq plats Petri de six centimètres 50% confluents et laver les cellules avec environ 1,8 millilitres de trypsine à l’aide d’une pipette pasteur stérile de neuf pouces en coton branché. Ajouter ensuite 200 microlitres de trypsine par plaque et faire tourbillonner la plaque pour déloger les cellules attachées. Observez les cellules sous microscopie de contraste de phase avec un objectif 4X pour s’assurer qu’elles ont commencé à déloger.
Ensuite, aspirez environ 1,5 millilitres de HC11 moyen avec une pipette pasteur stérile de neuf pouces et gicler verticalement contre les cellules tout en tournant le plat en s’assurant d’éviter les éclaboussures. Transférer toutes les cellules dans la bouteille avec HC11 moyen et tourbillonner pour se disperser uniformément dans la bouteille. Puis aliquot la suspension cellulaire en 20 boîtes de Pétri de trois centimètres par pipetting deux millilitres de cellules par plat.
Rock les boîtes de Petri pour répandre les cellules et les incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain, lorsque les cellules sont 90 à 100% confluent, aspirer le milieu et le remplacer par moyen par FBS, mais sans FEM. Après avoir fait pousser les cellules à moyen sans FEM pendant 24 heures, ajouter le milieu de différenciation à 10 plats et faire pousser les cellules jusqu’à 10 jours en gardant les 10 autres plats comme témoins.
Changez le milieu tous les deux à trois jours avec les cellules traitées hip et de contrôle. Pour surveiller la différenciation, observez les cellules avec la microscopie de contraste de phase. Utilisez la microscopie par fluorescence si les cellules expriment des protéines fluorescentes vertes.
En outre, quantifier le degré de différenciation en extrayant des protéines des cellules traitées et de contrôle hip une fois par jour et en effectuant l’analyse western blot. Rassemblez et placez le milieu de croissance EpH4, la matrice EHS et deux tubes coniques de 50 millilitres sur la glace. Préchill les plaques de culture tissulaire avec des pointes pipette à moins 20 degrés Celsius et de préparer eph4 milieu de croissance complété par 10 ou 20% matrice en deux tubes coniques de 50 millilitres et les garder sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à utiliser.
Après avoir récupéré les plaques de culture tissulaire préchilées à moins 20 degrés Celsius, enduire 10 puits de la plaque de 24 puits de 150 microlitres de matrice non diluée en étalant la matrice à l’aide d’une pipette. Évitez de créer des bulles lors de la propagation de la matrice. Puis appuyez doucement sur les côtés de la plaque et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure pour permettre à la matrice de se solidifier.
Pendant ce temps, préparez-vous à la différenciation en trypsinisant les cellules EpH4 ainsi que précédemment décrit et en assurant des suspensions cellulaires simples après la résuspension des cellules trypsinisées. Ensuite, comptez les cellules en suspension à l’amiomètre. Transférer cinq fois 10 dans les quatre cellules par puits dans un tube de centrifugeuse conique stérile de 1,5 millilitre et les faire tourner à 250 fois g pendant cinq minutes.
Aspirez soigneusement le milieu supernatant et placez le tube sur la glace. Utilisez une pointe de pipette d’un millilitre pour résuspendre les cellules dans 350 microlitres de milieu de croissance EpH4 complété par une matrice de 20%, tout en gardant les tubes sur la glace en s’assurant d’éviter les bulles. Une fois que la couche inférieure s’est solidifiée, ajoutez les 350 microlitres de suspension cellulaire à chaque puits enduit et placez-le dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure pour permettre à la couche matricielle de 20 % de se solidifier.
Observez les cellules avec la microscopie de contraste de phase pour s’assurer que les cellules simples sont visibles. Ajouter ensuite 200 microlitres de milieu EpH4 avec 10% de matrice sur le dessus et incuber la plaque à 37 degrés Celsius. Commencez l’induction de différenciation un jour après le placage des cellules dans la matrice.
Retirez soigneusement 150 microlitres du milieu matriciel supérieur de 10 % et ajoutez 200 microlitres de milieu EpH4 contenant hip et 10% matrice et pour les contrôles ajouter un milieu matricielle de 10% sans HIP. Remplacer le milieu tous les deux jours jusqu’à 10 jours en surveillant la formation de mammosphère par une microscopie à contraste de phase. Pour quantifier la différenciation, pipette soigneusement le milieu HIP 10% matrice des puits et rincer la couche matricielle de 20% avec 350 microlitres de PBS glacé.
Ajouter ensuite 70 à 100 microlitres de PBS glacé avec un millimolaire EDTA directement dans les puits et détacher doucement la couche inférieure de la matrice à 100 % avec une pointe de pipette. Agiter doucement l’assiette à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Transférer délicatement la suspension sphéroïde dans un tube conique et rincer les puits avec 500 microlitres de PBS EDTA pour récupérer les sphéroïdes restants.
Rock le tube sur la glace pendant 30 minutes supplémentaires en s’assurant que la matrice se dissout complètement. Si des touffes matricielles visibles sont vues, ajoutez plus de PBS EDTA ou secouez plus longtemps. Centrifugeuse de la solution à 350 fois g pour pelleter les sphéroïdes.
Puis aspirer le supernatant, lyse les sphéroïdes, et sonder les cellules pour la bêta-caséine, cycline D1, et p120RasGAP par ballonnement occidental. Il existe une dépendance frappante de différenciation sur la force du signal Rac dans les cellules HC11. Alors que le CRAC1 endogène est nécessaire pour la différenciation et de faibles niveaux de RacV12 activé par mutation provoquent une augmentation de la capacité de différenciation, des niveaux élevés de RacV12 déclenchent un bloc de différenciation et induisent la néoplasie.
Quand les propriétés de différenciation des cellules d’EpH4 ont été explorées dans une culture de matrice 3D, il a été constaté que la production de bêta-caséine a culminé à huit à 10 jours et l’expression de cyclin D1 était maximale à quatre à six jours après stimulation de HIP. Pour déterminer le positionnement des cellules individuelles, elles ont été tachées de DAPI et photographiées avec une microscopie confoccale. La mort interne de cellules et la formation des lumens creux ont été observées dans les mammosphères tandis que l’addition de HGF a eu comme conséquence la formation des structures tubulaires.
Quelqu’un effectuant cette technique pour la première fois doit garder à l’esprit que le placage des cellules HC11 est important. Une extraction correcte des cellules EpH4 de la matrice est également essentielle à la quantitation des protéines, car tout résidu affectera la détermination des protéines. Cette technique peut être utilisée pour étudier d’autres transducteurs de signaux qui peuvent se comporter de la même manière.
S’il y a des mutations de conducteur dans un cancer, alors leur inhibition complète ne sera pas nécessaire puisque de bas niveaux restants induisent réellement la différenciation.
