Le micropatterning est une technique puissante utilisée par les scientifiques pour comprendre les liens entre la forme des cellules et l’activité des machines intercellulaires. Bien que plusieurs techniques permettent aux chercheurs de moduler la forme des cellules, ces techniques nécessitent souvent des équipements spécialisés inaccessibles à certains laboratoires de biologie. Cette vidéo vous guidera à travers les étapes nécessaires pour automatiser le micropatterning sur un système d’imagerie multiphotonique disponible dans le commerce.
L’un des avantages de ce protocole est qu’il évite l’utilisation d’équipements spécialisés. Les motifs peuvent également être facilement modifiés sans refabrication de photomasques, ce qui est généralement le processus le plus long en micropatterning. Notre outil de traitement d’images génère des images cellulaires moyennes qui reflètent une distribution représentative des protéines de manière impartiale et automatisée.
Bien que nous utilisions des lamaux de couverture dans nos expériences, le flux de travail automatisé vous permet également de modeler sur des lames et des plats à fond de verre. La démonstration visuelle de cette méthode est importante car une configuration appropriée du microscope est essentielle pour que le système image, identifie le plan focal correct et le motif de manière automatisée. Préparez la solution PVA comme indiqué.
Ajoutez une partie HCL à huit parties PVA. Inversez soigneusement le tube quelques fois pour mélanger. Versez deux millilitres de la solution dans une petite boîte de Pétri et plongez une lamelle de couverture prétraitée propre dans le liquide.
Incuber à température ambiante pendant cinq minutes sur un agitateur. Retirez soigneusement la lamelle de couverture de la solution. Utilisez le spinner de lamelle de couverture pour faire tourner le revêtement pendant 40 secondes.
En attendant, nettoyez la pince à épiler. Transférer la lamelle dans une boîte et sécher à quatre degrés pendant la nuit. Allumez le logiciel du microscope.
Tout d’abord, réglez la ligne laser à 750 nanomètres. Ensuite, configurez une nouvelle configuration optique appelée Image. C’est la configuration optique de base qui nous permet d’imager la lamelle à travers des réflecteurs.
Laissez les autres options par défaut et sélectionnez l’objectif approprié. Configurez les paramètres matériels sous cette configuration optique. Réglez le laser infrarouge comme notre laser de stimulation.
Placez le séparateur de faisceau dans le chemin de la lumière pour utiliser le laser IR pour l’imagerie. Sélectionnez le scanner Galvano et le détecteur de scan D approprié. Sélectionnez une taille de numérisation et un temps d’arrêt suffisants pour capturer de petites entités sur la lamelle de couverture.
Assurez-vous que la case Utiliser le laser IR est cochée. Ajustez la puissance du laser d’acquisition et la sensibilité du détecteur pour obtenir une image lumineuse, mais non saturée, de la surface de la lamelle. Dans la fenêtre de la zone de balayage, définissez le zoom sur un pour capturer l’ensemble du champ de vision.
Enregistrez la configuration optique. Nous allons maintenant mettre en place une série de configurations optiques qui permettront au microscope de se concentrer, de charger le masque de retour sur investissement et de générer des motifs de manière automatisée. La première configuration optique nous permet d’imprimer un marqueur fiduciaire utilisé pour se concentrer automatiquement sur le champ de vision actuel.
Dupliquez la configuration optique de l’image et renommez-la, Marqueur fiduciaire d’impression. Puisque nous imprimons dans cette étape, déplacez le séparateur de faisceau hors du chemin de la lumière et remplacez-le par un miroir dichroïque approprié. Sélectionnez la plus petite taille d’analyse pour gagner du temps.
Étant donné qu’aucune imagerie n’est requise dans cette étape, réglez la sensibilité du détecteur sur zéro. Augmentez la puissance laser pour permettre l’impression. Dans la fenêtre de la zone de balayage, définissez le zoom au maximum et placez la zone de balayage au milieu du champ de vision.
Nous allons maintenant mettre en place une expérience de pile Z pour tenir compte de toute inégalité dans la surface PVA. Définissez le mouvement à la position Z sur relatif. Sélectionnez le périphérique Z approprié.
Ensuite, dupliquez la configuration optique de l’image et renommez-la, Mise au point automatique. Sélectionnez la plus petite taille d’analyse et diminuez le facteur de zoom dans la fenêtre de la zone de balayage afin que le champ de vision soit légèrement plus grand que le marqueur fiduciaire. Cela garantit que d’autres petites fonctionnalités sur la lamelle de couverture n’interféreront pas avec la mise au point automatique.
Dans le menu Périphériques, sélectionnez Configuration de la mise au point automatique. Définissez l’épaisseur de balayage sur celle de l’expérience Z-stack. Le microscope balaiera cette plage et trouvera le meilleur plan focal à l’aide du marqueur fiduciaire.
Ensuite, dupliquez la configuration optique de l’image et renommez-la, Charger le retour sur investissement. Définissez la taille de balayage identique à celle du masque roi car le masque sera chargé sur une image prise avec cette configuration optique. Nous avons utilisé 2048 pixels pour atteindre un équilibre optimal entre la résolution et la vitesse.
Maintenant, nous allons mettre en place la configuration optique utilisée pour modeler la lamelle de couverture. Dupliquez la configuration optique du marqueur fiduciaire d’impression et renommez-la Micropattern. Définissez le facteur de zoom sur un.
Augmentez la puissance du laser de stimulation pour abréger le PVA. Sélectionnez une vitesse de balayage appropriée. Dans la fenêtre de stimulation ND, configurez une expérience de stimulation ND.
Ajoutez quelques phases au calendrier et définissez chacune à la stimulation. Assurez-vous que la zone de stimulation et la durée sont correctes. Dans la même fenêtre, activez la fonction Z principale de déplacement de l’étape avant chaque phase.
Cela tient compte à nouveau de tous les écarts dans la direction Z. Enfin, configurez une configuration optique pour faire une étiquette visible sur la lamelle qui peut nous aider à localiser les motifs. Dupliquer le marqueur fiduciaire d’impression et le renommer, Surface de l’étiquette.
Augmentez considérablement la puissance du laser et réglez le zoom sur un. Transférer la lamelle recouverte de PVA sur un support. Pour un microscope vertical, assurez-vous que la surface de l’AVP est exposée vers le bas.
Ajoutez de l’eau aux coins pour stabiliser la lamelle. Montez le support sur l’étage du microscope. Abaissez l’objectif et ajoutez de l’eau entre les deux.
Dans le logiciel du microscope, allumez l’obturateur laser IR et effectuez l’alignement automatique avant le modelage. Basculez vers la configuration optique de l’image. Scannez le champ de vision tout en rapprochant lentement l’objectif de la lamelle de couverture.
Au début, l’image apparaîtra extrêmement sombre. Rapprochez l’objectif de la lamelle jusqu’à ce que la luminosité de l’image augmente légèrement. Il s’agit de la surface de lamelle qui fait face à l’objectif.
Continuez à déplacer l’objectif jusqu’à ce que la luminosité diminue et augmente à nouveau. C’est la surface PVA que nous allons modeler. Concentrez-vous sur toute petite fonctionnalité, telle que les imperfections de la lamelle ou la poussière, et définissez zéro sur le lecteur Z.
Passez à la configuration optique de surface d’étiquette. Cliquez sur Capturer. Retour à l’imagerie et à la numérisation.
Les dommages causés au verre montrent que l’étiquette a été imprimée avec succès. Déplacez la scène d’un à deux champs de vision pour éviter les particules de verre. Analyse pour confirmer.
Dans le menu des périphériques, ouvrez la macro de mouvement de scène. Définissez les variables M et N sur le nombre souhaité de champs de vues qui seront modelés. Enregistrez et exécutez la macro.
Une fois le patterning terminé, passez à la configuration optique de l’image et parcourez les motifs. Les îlots modèles dans chaque champ de vision doivent avoir des bordures claires et refléter la lumière uniformément. Les modèles qui semblent plus sombres et inégaux suggèrent l’enlèvement incomplet de PVA.
Cela est généralement dû à une puissance laser insuffisante ou à un plan focal incorrect. Si la puissance laser est trop élevée, cela peut également provoquer une bulle de l’AVP. Après avoir plaqué les cellules sur les lamaux de couverture, les cellules doivent se propager et prendre la forme du motif.
Il s’agit d’une image d’immunofluorescence d’un fibroblaste humain plaqué sur un motif d’arbalète. La cellule présente un bord riche en actine de lamellipodia. Fibres de contrainte ventrales épaisses le long des deux côtés et fibres de contrainte dorsale reliées par des arcs transversaux.
La chaîne légère de myosine s’est assise derrière le bord dense de lamellipodia et a montré un motif strié le long des faisceaux d’actine. À l’aide de notre outil de traitement d’image personnalisé, nous avons généré une image moyenne de nos protéines d’intérêt. Cette image montre que les structures d’actine décrites ci-dessus sont cohérentes sur un grand nombre de motifs.
Bien que nous perdions des structures individuelles de la myosine après avoir fait la moyenne, sa localisation le long des faisceaux d’actine est conservée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de configurer un flux de travail de micro-modelage à l’aide d’un système multiphotonique disponible dans le commerce avec un travail manuel minimal. Il est important d’optimiser la puissance laser pour votre propre système afin d’éviter de générer des motifs incomplets ou PVA Une efficacité maximale peut être obtenue en ajustant les paramètres dans les étapes de mise au point automatique et de micropatterning.
En plus d’étudier les voies cellulaires impliquant la morphologie cellulaire, cette technique peut également être appliquée au dépistage des médicaments et à d’autres applications sensibles aux variations de la forme cellulaire.
