Ce protocole est significatif parce qu’il permet la génération d’organoïdes testicules, qui peuvent être utilisés comme une plate-forme pour étudier la morphogenèse des testicules et pour les dépistages de médicaments tropo élevés et de toxicité. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est hautement reproductible, nécessite un nombre relativement faible de cellules et peut être utilisée pour générer un grand nombre d’organoïdes testiculaires avec une architecture spécifique aux testicules. Cette méthode peut être appliquée pour étudier d’autres systèmes, tels que les cellules souches pluripotentes ou les cellules des îlots pancréatiques avec les optimisations nécessaires.
Anna Voigt, doctorante de mon laboratoire, démontrera la procédure de digestion enzymatique des tissus testiculaires. Recueillir les testicules dans un bécher stérile et laver avec PBS contenant 1% de streptomycine de pénicilline. Après lavage transférer le testicilline à un plat de culture de tissu de 100 millimètres avec PBS contenant 1% de streptomycine de pénicilline.
Utilisez des ciseaux et des forceps autoclavés pour enlever le tunica vaginalis et l’épididyme. Transférer les testicules isolés dans un nouveau plat de 100 millimètres et bien laver avec du PBS contenant 1% de streptomycine de pénicilline. Couper les testicules le long de l’axe longitudinal directement sous la tunica.
Peler ensuite les testicules de la tunica à l’aide de deux forceps et les placer dans un nouveau plat de 100 millimètres contenant 1 millilitre de DMEM avec 1% de streptomycine de pénicilline. Hacher les testicules pelés avec des ciseaux stériles en morceaux de tissu d’un à deux millimètres. Après hacher utiliser des forceps stériles pour enlever les fragments blancs de tissu conjonctif.
Transférer les morceaux de tissu hachés dans la solution A dans un tube de 50 millilitres et le recharger jusqu’à 50 millilitres avec DMEM pour obtenir une concentration de 0,4 milligramme par millilitre pour la colagénase 4S et une concentration de 0,8 milligramme par millilitre pour colagenase 4W. Placez le tube contenant les morceaux de tissu dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Inverser doucement le tube toutes les cinq minutes.
Après 30 minutes, centrifuger le tube à 90 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant 1,5 minutes. Jetez le supernatant, annoncez 40 millilitres de solution B, et rechargez jusqu’à 50 millilitres avec DMEM pour obtenir une concentration de 1,2 milligramme par millilitre de colagenase 4W. Placez le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes et inversez doucement le tube toutes les cinq minutes.
Centrifuger le tube à 90 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant 1,5 minutes. Après cela jeter le supernatant, et laver une fois avec PBS avec 1% streptocotomycine pénicilline. Recueillir soigneusement les tubules par le haut et les placer dans un nouveau tube de 50 millilitres.
Recharger le tube avec PBS jusqu’à 50 millilitres. Centrifuger les tubules à 90 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant 1,5 minutes. Jetez le supernatant et ajoutez du PBS frais pour le laver deux fois de plus.
Après le dernier lavage PBS enlever le supernatant et re-suspendre les tubules séminifères en cinq millilitres de PBS. Ensuite, ajouter 15 millilitres de 0,25%Trypsin EDTA aux tubules. Placez le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius et inversez doucement toutes les deux minutes.
Après cinq minutes évaluer la digestion enzymatique des tubules à des cellules simples sous le microscope avec 10 microlitres d’échantillon sur une plaque de culture tissulaire. Toutes les deux minutes, placez l’échantillon sous le microscope pour l’observer. Si la plupart des cellules simples peuvent être détectées arrêter la réaction avec cinq millilitres de FBS et filtrer à travers un maillage de 70 microns, puis à travers un maillage de 40 microns.
Centrifuger les cellules individuelles à 500 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Re-suspendre en 50 millilitres de milieu d’enrichissement, et compter le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémomètre. Transférer 20 millions de cette population de cellules de départ dans chacune des deux boîtes de Pétri ultra-faibles de 100 millimètres et incuber dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 21 % d’oxygène pendant deux jours.
Céder 20 à 25 millions de cellules de la population restante de cellules de départ par plat de culture tissulaire de 100 millimètres dans un volume total de huit millilitres de milieu d’enrichissement. Placez le plat dans un incubateur et après 1h30 assurez-vous que la majorité des cellules sertoli sont fixées à l’assiette. Inclinez légèrement deux plaques pour recueillir et combiner les supernatants dans une nouvelle plaque de 100 millimètres et placez-la de nouveau dans l’incubateur.
Après une heure, mélanger à nouveau les supernatants de deux plaques à une nouvelle plaque de 100 millimètres. Remettre les assiettes dans l’incubateur toute la nuit. Puis recueillir les cellules germinales enrichies en deux fractions, fraction non adhérente et fraction légèrement adhérente.
Recueillir le supernatant comme la fraction non adhérente. Pour la fraction légèrement adhérente laver les assiettes doucement avec PBS et traiter avec deux millilitres d’une dilution d’un à 20 de 0,25%Trypsin EDTA pendant cinq minutes à température ambiante. Arrêter la réaction en ajoutant deux millilitres de milieu d’enrichissement et de recueillir dans le tube fraction non adhérent.
Combinez la préparation des cellules de départ et les cellules germinales enrichies dans un tube pour obtenir une préparation cellulaire de travail contenant 25% de cellules germinales. Centrifugeuse à 500 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez les cellules en 20 millilitres de milieu de formation organoïde pour atteindre une concentration de 2,4 millions de cellules par millilitre.
Dans un nouveau tube ajouter un millilitre de la solution contenant des cellules. Ajouter 0,5 millilitres de solution de rinçage surfactant à chaque puits dans une plaque de micro puits. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est emprisonnée dans le puits.
Pour enlever les bulles d’air centrifuger la plaque à 2000 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant deux minutes. Observez la plaque sous un microscope inversé à faible grossissement pour vérifier que les bulles ont été retirées des micro puits. Couvrir la plaque d’un couvercle et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
Une fois le traitement terminé, retirez la solution de rinçage et lavez immédiatement la plaque avec de l’eau stérile ou du PBS. Ajouter 0,5 millilitres de milieu de formation organoïde à chaque puits et centrifugeuse à 2000 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant deux minutes pour éliminer les bulles d’air emprisonnées. Observez le puits sous un microscope inversé à faible grossissement pour vérifier que les bulles d’air ont été enlevées.
Ajouter 0,5 millilitres de la suspension de la cellule de travail et mélanger délicatement en pipetting de haut en bas. Centrifugeuse à 500 fois G avec des pauses à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Utilisez un microscope inversé pour vérifier que les cellules se sont regroupées dans les micro puits.
Transférer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire et la culture pendant cinq jours. Changez la moitié du milieu tous les deux jours. Pour récupérer les organoïdes, utilisez une pipette à large bouche pour pipette doucement le milieu de haut en bas.
Cela permet aux organoïdes de sortir des micro puits. Recueillir les organoïdes, fixer et effectuer la cytochimie immuno pour marqueur de cellules germinales, marqueur cellulaire Sertoli, marqueur cellulaire myoïde péritubulaire et marqueur cellulaire Leydig et visualiser sous un microscope confocal. Dans cette étude, les cellules isolées des testicules porcins d’une semaine qui ont été cultivés dans des micro puits auto-organisés en sphéroïdes avec des compartiments extérieurs et intérieurs délimités et distincts.
Les deux compartiments ont été séparés par une membrane positive de sous-sol de collagène IV. Les cellules sertoli positives GATA4 et les cellules germinales positives UCHL1 se trouvaient dans le compartiment extérieur de la membrane du sous-sol. Les cellules myoïdes péri tubulaires positives d’aSMA ont été localisées le long de l’intérieur de la membrane de sous-sol tandis que les cellules positives de Leydig de CYP450 étaient au centre de l’interstitium.
Cette structure est similaire aux conditions in situ, où les cellules Leydig, cellules myoïdes péri-tubulaires, sont situées dans l’interstitium, dans le compartiment interstitiel et les cellules germinales, les cellules sertoli sont situées à l’épithélium séminifère. Il est important de s’assurer que les cellules utilisées pour générer des organoïdes ont une qualité optimale. Une attention particulière doit être accordée pendant le stade de trypsinisation de la digestion enzymatique.
Après cette procédure, les organoïdes peuvent être cultivés à long terme pour étudier la différenciation des cellules germinales ou analyser l’expression des gènes et les protéines ou hormones sécrétées. La capacité de créer des organoïdes avec des associations cellulaires spécifiques aux testicules fournit un nouveau système in vitro pour étudier les interactions cellule-cellule importantes pour le développement des testicules et la fonction des cellules germinales.
