Ce protocole nous permet d’étudier les stents d’échappement des médicaments dans un petit modèle animal de sténose laryngotracheal nous permettant de tirer parti des animaux génétiquement modifiés d’une manière rentable. Le placement transoral du stent de voie aérienne drogue-eluting épargne les animaux d’une incision ouverte dans la trachée représentant un modèle plus médicalement pertinent de sténose laryngotracheal. Cette technique facilite l’investigation préclinique des stratégies locales d’administration de drogue pour traiter la sténose laryngotracheal.
Cette technique fournit une plate-forme réalisable et efficace pour l’étude translationnelle des endosseurs de voies respiratoires d’échappement de drogue dans un modèle de petit animal qui peut être appliqué pour l’étude future dans de plus grands modèles animaux aussi bien que l’application clinique. particulièrement l’intubation transorale, l’induction des dommages de trachée, et l’étape de placement d’enfilent de voie aérienne. Démonstration visuelle de cette chirurgie techniquement difficile est critique que beaucoup de détails fins ne peuvent pas être entièrement décrits en mots.
Pour faire une solution de polymère contenant 1% de rapamycine, ajoutez six milligrammes de rapamycine à 600 milligrammes de 70-30 PLLA-PCL dans un flacon de verre. Sous un capot de fumée, ajouter six millilitres de dichloromethane au flacon complété et contrôler la rapamycine et ajouter 120 microlitres de glycérol à chaque flacon. Ensuite, plafonnez les flacons et laissez la solution PLLA-PCL homogénéiser pendant six à 12 heures à température ambiante.
Pour créer un enfilage des voies respiratoires murines, à l’aide de matériaux stériles et de techniques, appliquez un millilitre de rapamycine complété la solution PLLA-PCL sur la canule veineuse d’un propylène fluoré de 22 jauges à base d’angiocathéter à base d’angiocathéter tout en ralentissant la rotation du cathéter. Lorsque toute la solution a été appliquée, soutenir l’angiocathéter moulé avec la pointe de l’angiocathéter orienté vers le bas et la poignée du cathéter sur le bord d’une boîte de Pétri en verre dans une hotte sous vide. Après 24 heures sous vide à température ambiante, tordez et faites glisser doucement le cathéter de la construction de stent séchée et vérifiez circonférentiellement le stent pour tous les défauts qui pourraient avoir résulté pendant le processus de coulée.
Pour faciliter la visualisation, il est utile de tracer une mince ligne noire sur toute la longueur de l’enfilage. Coupez chaque extrémité des enfilents moulés avec de fins ciseaux droits de sorte que les bords soient axiaux et utilisez les ciseaux pour couper chaque enhent en segments axiaux de trois millimètres. Chargez ensuite chaque stent de trois millimètres sur un nouveau cathéter veineux de calibre 22.
Pour l’induction de sténose laryngotracheal, après confirmation d’un manque de réponse au pincement d’orteil, placez la première souris sur une plate-forme chirurgicale dans la position de supine et bouclez un petit morceau de fil fixé au dessus de la plate-forme autour des incisives centrales. Fixez les membres à la table avec du ruban adhésif et faites une incision verticale médiane de 1,5 centimètre dans le cou de la souris. Divisez le thymus qui s’enlise etéralisez les deux lobes qui en résultent pour visualiser la trachée.
Divisez les muscles sternohyoid et sternothyroid overlying à l’attachement supérieur bilatéralement et passez un angiocatheter de calibre 22 transorally par le larynx dans la trachée. À l’aide de petits forceps, appliquer une pression sur le larynx antérieur de la souris pour faciliter le placement correct du cathéter. Un angiocathéter correctement placé peut être visualisé par sa couleur blanche à travers la trachée.
Pour induire la blessure, passez une brosse en fil enduit de bleomycine à travers l’angiocathéter inséré et retirez lentement le cathéter de sorte que seule la brosse de fil reste dans la trachée. À l’aide de forceps fins, appliquer une contre-pression sur la trachée pour perturber mécaniquement le lumen trachéal avec la brosse avant de réinsérer le cathéter dans la trachée au-dessus de la brosse. Retirez la brosse à fil et réappliquez la bleomycine avant d’insérer et d’enlever la brosse quatre fois de plus comme cela vient d’être démontré.
Après la dernière application de bleomycine, retirer le cathéter de la trachée. Pour le placement transoral d’un PLLA-PCL, assurez-vous qu’une mince ligne verticale noire a été incorporée dans chaque stent et intuber transorally la souris avec l’angiocathéter préchargé. Le stent doit être visualisé dans la trachée par l’incision transcervicale.
Lorsque le stent est en place, utilisez des forceps fins pour saisir fermement mais doucement la trachée à travers l’incision pour maintenir le stent en place et enlever le cathéter. Il est essentiel de placer le stent aussi soigneusement que possible. Trop de pression sur la trachée entraînera l’effondrement du stent causant l’obstruction des voies respiratoires et la mort de l’animal.
Fermez l’incision avec de la colle tissulaire ou des sutures chromiques absorbables 4-0 utilisées ici et permettez à la souris de récupérer avec surveillance avant de retourner l’animal dans sa cage d’origine. Au point de terminaison expérimental approprié, placez la souris d’intérêt dans la position de supine sur la plate-forme chirurgicale et utilisez les ciseaux incurvés fins d’iris pour rouvrir l’incision. Exposez la trachée comme démontré et utilisez les ciseaux pour diviser la trachée distale au-dessous du niveau du stent.
Ensuite, divisez la trachée proximale au-dessous du larynx et au-dessus du stent et séparez la trachée divisée de l’œsophage postérieurement. Retirez ensuite le stent de la trachée et fixez la trachée dans 10% de formaline pendant 24 heures. La construction de stent PLLA-PCL chargée de rapamycine biodégradable utilisée dans cette étude est capable d’éluder la rapamycine d’une manière cohérente et prévisible dans des conditions physiologiques.
Dans cette image, le stent biocompatible miniaturisé peut être observé in situ dans la trachée comme indiqué par le marqueur noir sur le stent visualisé par la trachée translucide de souris. Après 21 jours, le marqueur de colorant noir peut être utilisé pour confirmer le maintien de la position de stent dans la trachée. Les tests de biocompatibilité utilisant la coloration immunofluorescente pour les marqueurs de l’inflammation aiguë et chronique démontrent que la construction de stent PLLA-PCL n’est pas immunoréactive déterminée par le nombre minimal de cellules immunitaires présentes après le placement en l’absence de blessure.
Manipuler les voies respiratoires d’une manière délicate et atraumatique est essentiel au succès de la procédure. Une force excessive, de multiples intubations et un effondrement de stent peuvent entraîner la mort d’animaux. Après traitement avec le stent rapamycine-eluting, l’évaluation de la survie, l’expression de gène par PCR en temps réel quantitatif, l’immunoassay comprenant la cytométrie de flux, ELISA, et l’immunohistochimie peuvent être exécutées.
Comme il fournit une plate-forme réussie pour l’élitution des médicaments dans un modèle de souris, cette technique ouvre la voie à de futures investigations de thérapeutiques appliquées localement dans la sténose laryngotracheal. Le dichloromethane est un liquide corrosif. Assurez-vous d’utiliser toujours un capot à fumée, un équipement de protection individuelle et des matériaux non corrosifs
