Notre protocole démontre que l’ECM peut favoriser la différenciation adipogenic en l’absence des médiateurs adipogenic classiques et est le premier à démontrer la régulation maladie-spécifique du métabolisme cellulaire par l’ECM. Notre technique fournit un outil pour disséquer les rôles de l’ECM et des adipocytes dans le métabolisme des tissus adipeux et permettre l’étude du rôle de l’ECM dans la régulation de l’homéostasie des tissus adipeux. Comparé à la culture standard de cellules 2D, notre modèle 3D permet l’examen et la dissection plus robustes de la conversation croisée entre les adipocytes et l’ECM de tissu adipeux dans le contexte du diabète de type 2.
Nous recommandons de commencer par des échantillons plus petits pour évaluer dans quelle mesure il est cellulaire. Gardez à l’esprit qu’il existe une variabilité interpatiale dans la façon dont les cellules se développent et dans quelle mesure le tissu se décellularise. Il est important d’observer le tissu avant et après chaque étape pour s’assurer que le tissu est en train de se décellulariser et pour comprendre les différences potentielles entre les échantillons.
Après avoir obtenu le tissu adipeux viscéral ou la TVA de la chirurgie, préparez-le pour le stockage en ajoutant 5-10 grammes du tissu à 15-25 millilitres de solution tampon de congélation dans un tube conique de 50 millilitres. Immerger complètement l’échantillon et le conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la décellularisation. Pour l’isolement des préadipocytes, placez deux grammes d’un échantillon frais de TVA intacte dans 20 millilitres de solution de type II de collagène, puis insérez des ciseaux stériles dans le tube et hachez soigneusement le tissu.
Une fois haché dans une boue fine, l’incuber dans la solution de collagène à 37 degrés Celsius sur un shaker orbital pendant 60 minutes. Après l’incubation, filtrer le résultat digéré à travers un maillage en nylon de 100 micromètres dans un tube conique frais de 50 millilitres. Le digéré doit être un liquide jaune-orange avec une viscosité modérée et une petite quantité de brins résiduels de tissu non digéré.
Centrifuger l’échantillon à 270 fois g pendant 10 minutes, enlever le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire en deux millilitres de solution de lysage RBC 1X avec une pipette. Incuber la solution pendant une minute à 25 degrés Celsius, puis ajouter 10 millilitres de 15%FBS DMEM F12 et la centrifuger à 270 fois g pendant 10 minutes. Pour préparer l’ECM, congeler/décongeler l’échantillon de TVA préalablement congelé à 37 degrés Celsius en l’incubant dans un bain d’eau préchauffé pendant 20 minutes avec une agitation manuelle périodique douce.
Une fois décongelé, transférez le tissu à moins 80 degrés Celsius pendant 20 minutes et répétez le processus de gel/dégel trois fois se terminant par la décongélation. Utilisez des forceps stériles pour transférer l’échantillon de TVA dans un tube conique frais de 50 millilitres contenant de 15 à 25 millilitres de solution enzymatique 1 en s’assurant que l’échantillon est complètement immergé. Puis l’incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius tout en secouant à 130 RPM.
Le lendemain, lavez l’échantillon trois fois avec 15-25 millilitres de solution tampon de rinçage, versant la solution après chaque lavage. Transférer l’échantillon dans un tube frais de 50 millilitres avec 15-25 millilitres de solution enzymatique 2 et l’incuber pendant la nuit. Répétez les lavages avec la solution tampon de rinçage et transférez l’échantillon dans un tube frais contenant de 15 à 25 millilitres de solution d’extraction de solvant polaire.
Incuber l’échantillon toute la nuit en secouant. Après incubation avec la solution de solvant polaire, il est important d’examiner l’échantillon pour l’élimination des lipides. Si la majeure partie du lipide n’est pas enlevée, il peut être nécessaire de répéter cette étape.
Un temps d’incubation plus court peut être utilisé. Après l’incubation, transférer l’échantillon dans un tube frais contenant de 15 à 25 millilitres de solution tampon de rinçage et laver l’échantillon trois fois sur le shaker. Lavez ensuite l’échantillon trois fois avec une solution à 70 % d’éthanol, en versant l’éthanol après chaque lavage.
Lavez l’échantillon une fois avec la solution de stockage, puis utilisez des forceps stériles pour transférer dans un tube frais contenant 15-25 millilitres de solution de stockage en s’assurant de l’immerger complètement. L’échantillon peut ensuite être conservé à quatre degrés Celsius pendant une période d’un mois. L’isopropanol et l’éthanol sont inflammables et doivent être à température ambiante et éliminés dans des déchets inflammables.
Tous les déchets humains doivent être éliminés séparément des déchets biorisques habituels. Transférer les fragments d’ECM stockés dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits avec des forceps stériles ajoutant autant de fragments que nécessaire pour les analyses prévues en aval. Lavez-les trois fois avec 500 microlitres de 70% d’éthanol sur un shaker orbital, puis réhydratez-les en les lavant trois fois avec du PBS.
Utilisez des ciseaux stériles pour couper l’ECM en fragments de 100 milligrammes. Placez chaque fragment dans un puits d’une plaque de 24 puits et incubez la plaque à 25 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre à l’excès de PBS d’extruder des fragments. Retirez ensuite soigneusement les restes de PBS des puits à l’aide d’une pipette.
Ensemencer chaque fragment avec 20 microlitres de suspension cellulaire préadipocyte en pipetant les cellules directement dans l’ECM. Placez la pointe de pipette dans l’ECM et expulsez-la doucement au centre de la matrice en vous assurant que la suspension cellulaire ne déborde pas et ne se retrouve pas au fond du puits. Si la suspension cellulaire déborde de l’ECM, retirez la pointe pipette de cet endroit et insérez-la ailleurs dans l’ECM.
Après l’ensemencement cellulaire, incuber l’ECM pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius. Remplissez chaque puits de 500 microlitres de supports de croissance pour couvrir les fragments d’ECM ensemencés. Culture des cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures.
Après 72 heures, aspirez soigneusement le média de croissance sans perturber le fragment d’ECM. Ajouter 500 microlitres de médias de différenciation et de culture des cellules pendant 14 jours en changeant les médias tous les deux à trois jours. Vérifiez la différenciation à l’aide d’une microscopie légère.
Les cellules accumuleront des lipides, deviendront de couleur brun-jaune et deviendront plus sphériques à mesure qu’elles se différencieront. La préparation de l’ECM de tissu adipeux, l’ensemencement avec des preadipocytes, et la différenciation in vitro dans les adipocytes mûrs ont été surveillés avec la microscopie électronique de balayage qui a indiqué la dcellularisation de l’ECM et la récapitulation suivante des lipides contenant des adipocytes sur le résédage et la différenciation. Le collagène 1 immunohistochimie spécifique de l’ECM décellularisé a montré le maintien de la micro-architecture de collagène tandis que la coloration rouge-o d’huile des constructions vivantes et fixes d’ECM-adipocyte de 3D a montré le lipide contenant des adipocytes.
Les adipocytes différenciés dans ECM ont été examinés pour des gènes adipogenic utilisant le PCR en temps réel quantitatif qui a démontré que ces gènes sont upregulated dans les cellules différenciées par rapport aux préadipocytes indifférenciés cultivés dans ECM. La différence complète dans les niveaux de transcription est indiquée. Quatre combinaisons d’ECM et d’adipocytes des sujets diabétiques et nondiabetic ont été soumises au phénotypage métabolique.
L’absorption altérée de glucose dans la fonction lipolytique a été découverte dans des constructions des tissus diabétiques. Fait important, il a été constaté que l’ECM nondiabetic sauve l’absorption insuline-stimulée de glucose et la capacité lipolytique dans les adipocytes diabétiques. La contamination des préadipocytes isolés, du tissu décellulaire et de l’ECM réséqué n’est pas rare.
La stérilité doit être maintenue avec diligence tout au long du protocole.
