Un défi dans le domaine de la biologie adipeuse a été de maintenir l’adipocyte mûr dans la culture. Nous avons développé une nouvelle méthode qui permet l’étude des adipocytes à long terme tout au long de grands changements. Notre technique de culture des adipocytes permet l’étude des interactions cellulaires et nous espérons être utile pour le développement de nouveaux traitements pour le diabète et l’obésité.
Il est important de suivre attentivement le protocole car il ya quelques étapes critiques qui ont un impact considérable sur la qualité des gènes et la viabilité des adipocytes matures. Par exemple, avant le placage assurez-vous que tous les lipides libres et tampon de lavage a été enlevé sinon les lipocytes pourraient s’arracher lorsque les inserts sont inversés. Après avoir reçu l’échantillon de tissu adipeux sous-cutané humain, placez le tissu dans une armoire stérile de sécurité biologique dans une boîte de Petri de 15 centimètres.
Un petit volume de moyen 199 au plat. Utilisez des pinces à épiler pour saisir les gros vaisseaux fibrotiques dans le tissu et utilisez l’arrière de la pointe d’une paire fermée de ciseaux pour gratter doucement l’adipeux le long du navire pour libérer les adipocytes. Lorsque toutes les cellules ont été recueillies jeter les gros morceaux de tissu fibreux et peser la graisse taillée.
Pour libérer davantage les cellules du tissu adipeux, transférez 10 grammes de tissu adipeux dans une nouvelle boîte de Pétri de 15 centimètres et utilisez des ciseaux incurvés pour hacher soigneusement la graisse jusqu’à ce qu’elle devienne un mélange homogène lisse sans gros morceaux d’adipeux. Lorsque toute la graisse a été traitée, utilisez une cuillère pour transférer 10 millilitres de tissu haché dans des tubes individuels de 50 millilitres et ajouter 30 millilitres de tampon de digestion à chaque tube. Ensuite, placez les tubes dans un incubateur secouant à 37 degrés Celsius et 150 rotations par minute pendant 30 à 35 minutes.
La digestion est complète lorsque la solution adipeuse est homogène, de couleur abricot, et absente des gros morceaux. À la fin de la digestion, décanter la solution de graisse digérée dans un filtre à mailles de 250 micromètres à l’intérieur d’un entonnoir placé dans stérile flacon d’un litre. Lorsque tout le volume de suspension des adipocytes a été éludé, serrez doucement le filtre à mailles pour augmenter le rendement des adipocytes et lavez le filtre avec 50 à 100 millilitres de tampon de lavage avant de presser à nouveau le filtre.
Transférer la solution d’adipocytes isolés dans un entonnoir de séparation et ajouter le tampon de lavage jusqu’à ce que l’entonnoir soit presque complètement rempli. Inverser doucement l’entonnoir à quelques reprises pour mélanger la suspension des adipocytes avec le tampon et laisser reposer la suspension de deux à trois minutes jusqu’à ce qu’il y ait une séparation distincte des couches. Lorsque les couches se sont séparées, ouvrez la buse sur l’entonnoir et échappez lentement à la solution inférieure dans un flacon stérile.
Lorsque toutes les collagènes ont été enlevées, recueillir la solution purifiée d’adipocyte mature dans des tubes coniques de 50 millilitres et emballer légèrement les cellules par centrifugation. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 18 pour enlever le tampon de lavage restant sous la suspension des adipocytes et utilisez une pipette pour enlever la couche lipidique libre flottant au-dessus des adipocytes matures. Pour l’ensemencement des adipocytes matures, placez le composant d’insertion de membrane perméable à l’envers sur une surface stérile et inversez doucement les tubes des adipocytes emballés à quelques reprises pour assurer une distribution uniforme des cellules.
À l’aide d’une pointe de pipette à alésage large, ajouter 30 microlitres d’adipocytes matures emballés sur chaque membrane. Inverser le panneau d’insertion en un seul mouvement lisse de sorte que les adipocytes ensemencés sont sur le fond des inserts. Placez le panneau d’inserts dans une plaque de puits de 24 contenant 500 à 1000 microlitres de milieu complet de 37 degrés Celsius par puits.
Ensuite, couvrez la plaque et placez soigneusement la plaque dans un incubateur de culture tissulaire. Tous les sept jours de culture, remplacer le milieu par le trou de découpe dans chaque insert. Après une semaine de culture, les agrégats matures d’adipocytes isolés du tissu adipeux sous-cutané maintiennent la morphologie unilocular caractéristique de gouttelette de lipide observée seulement dans les adipocytes mûrs.
Le traitement par pioglitazone et rosiglitazone des agonistes PPAR-GAMMA entraîne une augmentation de l’expression des gènes sensibles PPAR-GAMMA, tandis que le traitement par la déxaméthasone agoniste des récepteurs glucocorticoïdes n’a aucun effet sur ces gènes. De même, l’agoniste des récepteurs glucocorticoïdes conduit solidement l’expression génétique des gènes cibles des récepteurs glucocorticoïdes, tandis que les agonistes PPAR-GAMMA n’ont aucun effet significatif sur ces gènes. En outre, le traitement de sept jours avec les agonistes de PPAR-GAMMA induit robustement l’expression de gène du gène spécifique de graisse brune, UCP1.
Notre nouveau modèle in vitro d’adipocyte peut être employé pour les études fonctionnelles dans les adipocytes mûrs, y compris l’absorption de glucose, la lipogenèse, et la lipolyse. Avec cette nouvelle technique de culture des adipocytes, nous avons pu montrer que les adipocytes blancs matures humains peuvent se transfferentiate en adipocytes bruns.
