Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales sur la dynamique des cellules progénitrices neurales et leur progéniture qui sous-tendent le développement du cerveau vertébré. Le principal avantage de cette technique est la capacité de visualiser directement plusieurs amas de cellules liées à la clonally dans le cerveau vivant pendant de nombreuses heures de développement. Le protocole peut également être appliqué à l’étude de la dynamique clonale et progénitrice dans d’autres systèmes en développement de l’embryon de poisson zèbre.
La visualisation utilisant cette méthode est particulièrement utile pour observer directement les processus fondamentaux qui se produisent pendant le développement neuronal. L’après-midi précédant l’exécution des micro-injections, installez du poisson zèbre adulte de type sauvage dans des réservoirs d’accouplement séparés par sexe. Le lendemain matin, préparez la solution ADN selon les directives manuscrites et injectez environ 4,2 nano litres de cette solution dans des embryons de poisson zèbre à cellules dans les 45 minutes suivant la fécondation.
Maintenir les embryons injectés dans E trois moyens et un incubateur de 28 degrés Celsius pendant 24 heures, puis appeler les embryons morts et déformés du groupe. Transférer jusqu’à 20 embryons en bonne santé dans un tube de 50 millilitres, le remplir de 10 millilitres de E trois et placer un bouchon sur le dessus de chaque tube. Placez une grille avec les tubes de 50 millilitres droit dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 80 à 90 minutes, en vous assurant que le niveau d’eau dans le bain est plus élevé que le E trois dans le tube.
Retirez la grille du tube du bain d’eau et placez-la dans l’incubateur de 28 degrés Celsius. Laisser refroidir jusqu’à une heure pour que les trois E refroidissent et que les embryons se réacclimatent à la température. Ensuite, transférez-les dans des boîtes de Pétri avec 0,2 millimolar PTU et E trois maintenus au chaud dans l’incubateur de 28 degrés Celsius.
À deux à quatre heures après le choc thermique, examiner les embryons sous un microscope standard de dissection de fluorescence pour l’expression de CFP ou YFP qui indique la recombinaison réussie de Brainbow. Sélectionnez les embryons avec une expression FP robuste partout et transférez-les dans un plat séparé avec PTU. Imagez-les un, deux ou trois jours après la fécondation.
L’expression qui apparaît faible sous un microscope de fluorescence peut effectivement être bien visualisée dans l’imagerie confocale de time-lapse. Avant le jour de l’expérience, préparez la chambre d’imagerie et l’outil de manipulation d’embryons. Pour préparer la chambre d’imagerie, supergluez soigneusement un anneau en plastique au centre d’une boîte de Pétri de 60 millimètres.
Construisez le manipulateur en collant super une petite longueur de ligne de pêche en nylon à l’extrémité d’un bâton d’écouvillon en bois de quatre pouces. Si nécessaire, déchorionner les embryons au microscope à dissection avant de monter. Pour monter les embryons, transférez le poisson au centre de l’anneau en plastique dans la chambre d’imagerie et enlevez autant d’excès de E trois que possible avec une pipette de transfert à pointe fine.
Utilisez une pipette de transfert propre pour couvrir le poisson avec un pour cent d’agarose de faible fonte et E trois, remplissant l’anneau en plastique entier avec une couche d’agarose. Puis tirez doucement l’embryon vers le haut dans la pointe de pipette et de nouveau dans l’agarose sans introduire de bulles d’air. Utilisez un manipulateur d’embryons pour orienter rapidement le poisson et l’agarose avant qu’il ne durcisse.
Si vous faites l’imagerie au microscope droit, placez l’embryon le plus près possible de la surface supérieure de l’agarose, en vous assurant qu’il est parallèle au fond de la chambre d’imagerie avec la queue droite. Attendez que l’agarose durcisse, puis remplissez la chambre d’imagerie avec E trois, en ajoutant autant que possible pour tenir compte de l’évaporation au cours de l’imagerie. Placez la chambre d’imagerie avec le poisson et E trois sur le microscope confocal.
Sélectionnez ensuite l’objectif avec une ouverture numérique élevée et une longue distance de travail. Trouvez une région avec un étiquetage suffisamment dense et lumineux des cellules et configurez les paramètres d’acquisition. Il s’agit d’un exemple utilisant le logiciel Zen, mais les paramètres varient en fonction des lignes de microscope et laser disponibles.
Préparez trois pistes pour imager chaque canal FP séquentiellement. Utilisez un laser argon pour exciter le CFP à 458 nanomètres et YFP à 514 nanomètres, et utilisez un laser nanométrique DPSS 561 pour exciter dTomato. Recueillir les missions pour les trois aux longueurs d’onde appropriées.
Sélectionnez la plage de pile Z à l’image et un intervalle de temps entre 10 et 30 minutes pour suivre les événements mitotiques et apoptotiques. Enfin, sélectionnez la durée de la session d’imagerie et exécutez l’expérience. Une fois l’imagerie terminée, enregistrez les données brutes au format CZI si vous utilisez zen ou un autre format compatible avec fidji, puis importez les images aux Fidji en utilisant l’importateur de formats biologiques.
La formation image multicolore in vivo de time-lapse a été employée pour montrer des clones codés de couleur de Brainbow des cellules dans la zone ventriculaire proliférante de l’hindbrain en développement de zebrafish. Les cellules étiquetées Brainbow disposées le long d’une fibre radiale particulière partageaient la même couleur. Qui peut être quantifié comme les poids relatifs du canal RVB.
Ceci suggère que ces groupes radio étaient des clones des cellules de division et que leur couleur semblable pourrait être employée pour les identifier comme étant clonally connexes. Une analyse quantitative des couleurs a montré que les cellules des filles expriment la même couleur que la cellule de leur mère. Mais que les grappes radio voisines de cellules peuvent être distinguées les unes des autres.
De nombreux clones de cellules apparentées peuvent être suivis simultanément pendant des heures in vivo, permettant une analyse et une comparaison de la lignée multiplexe. Quantification de l’expression des couleurs chez les clones à deux, puis à nouveau à trois jours après la fécondation a montré que l’expression Brainbow est resté relativement constant de deux à trois jours. La formation image de time-lapse a indiqué de nombreuses cellules subissant la migration nucléaire intercinétique et la division cellulaire d’un à deux jours après fertilisation, ce qui permet d’étudier le cycle cellulaire.
Un cycle cellulaire moyen de 8,4 heures a été calculé, ce qui est comparable aux mesures précédentes chez le poisson zèbre. En outre, cette technique d’imagerie a été utilisée pour observer les cellules individuelles subissant les changements morphologiques stéréotypés associés à l’apoptose, tels que le saignement de membrane et la fragmentation cellulaire. Parce que cette méthode est effectuée in vivo, le poisson zèbre peut être sauvé de la chambre d’imagerie et maintenu pour l’imagerie ou d’autres expériences à des moments ultérieurs.
L’utilisation de cette technique nous permet d’explorer de nouvelles questions sur les rôles des cellules clonally connexes pendant le développement neuronal.
