Name: live confocal imaging of developing arabidopsis flowers
Uploaded: 2017-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers at JoVE.com

L&#39;auteur souhaite remercier le professeur Elliot M. Meyerowitz pour son soutien, et les commentaires sur le manuscrit, ainsi que Ann Lavanway à Dartmouth College et le Dr Andres Collazo au Fonds pour l&#39;imagerie biologique à Caltech pour leur aide dans la résolution de problèmes techniques liés à la imagerie confocale en temps réel. Le travail de Nathanaël Prunet est pris en charge par les Instituts nationaux de la santé par le biais de Grant R01 GM104244 à Elliot M. Meyerowitz.

1. Médias et plats Préparation <ol><li> Préparer des plats de dissection en remplissant des boîtes en plastique ronde (environ 6 cm de largeur, 2 cm de profondeur) de 0,5 cm à 2% d&#39;agarose. </li><li> Préparer des plats d&#39; imagerie. <ol><li> Pour un microscope confocal en position verticale, à remplir des boîtes à charnière en plastique rectangulaire (environ 7 cm de long, 4,5 cm de large, 3 cm de profondeur) à 0,5 cm avec un milieu de formation d&#39;image (voir la section 1.3, &quot;moyen de création d&#39;image&quot;, la figure 1F). </li><li> Pour un microscope confocal inversé: remplir petite boîte de Petri (environ 3,5 cm de large, 1 cm de profondeur) exactement à ras bord par un milieu de formation d&#39;image (voir la section 1.3, « moyen de création d&#39;image », la figure 1G). </li></ol></li><li> Préparer le milieu de formation d&#39;image. <ol><li> Pour l&#39;imagerie en un seul point, en utilisant 1% d&#39;agarose. </li><li> Pour les expériences en accéléré, en utilisant un milieu de croissance de sommet (0,5 x mélange de sel basai de Murashige et Skoog sans vitamine, 1% de saccharose, 0,8% d&#39;agarose, pH 5,8 avec de l&#39;hydroxyde de potassiumsolution de e, complété avec de la vitamine [0,01% myo-inositol, 0,0001% d&#39; acide nicotinique, 0,0001% de chlorhydrate de pyridoxine, 0,001% de chlorhydrate de thiamine, de la glycine 0,0002%] et la cytokinine [500 nM N6-benzyladénine]) 15. </li></ol></li></ol> 2. la croissance des plantes <ol><li> Semer des graines stérilisées sur des plaques MS (0,5 ou 1x Murashige et le mélange de sel basai Skoog sans vitamine, 0,8% d&#39;agar, pH 5,8 avec une solution d&#39;hydroxyde de potassium) avec une sélection appropriée. Placer les plaques dans longue journée (16 h de lumière) ou le jour en continu, 16-22 ° C Conditions pendant deux semaines. </li><li> les jeunes plants sol avec un espacement ONTO suffisant pour permettre le développement robuste. Placez les plantes en jours courts, 16-22 ° C Conditions pour trois semaines. NOTE: La culture de plantes dans la journée ou les conditions de jour en continu directement après la transplantation conduit à une floraison prématurée et inflorescences qui sont moins vigoureux, et beaucoup plus difficiles à disséquer. De même, en laissant les plantes sous peu condit jourions pendant plus de trois semaines résultat en jours floraison longueur indépendante et inflorescences qui sont moins vigoureuses. </li><li> plantes de transfert à longue journée (16 h de lumière) ou le jour en continu, 16-22 ° C jusqu&#39;à ce que les conditions qu&#39;elles fleurissent. Pousses sont plus faciles à apex disséquer lorsque l&#39;inflorescence est 2-10 cm de long. </li></ol> 3. Dissection de la séance photos Apex <ol><li> En option: En utilisant une pierre à aiguiser fine et une goutte d&#39;huile légère, affûter une pince sous la loupe binoculaire pour les faire en forme de lame, non point comme. </li><li> Retirer siliques, boutons de fleurs anciennes et inflorescences secondaires de l&#39;inflorescence primaire en poussant la base des pédoncules avec la pince jusqu&#39;à ce qu&#39;ils cassent. Retirez autant de fleurs que possible sans grossissement (Figure 1, comparer A et B). </li><li> En utilisant des pinces, percer un trou vertical dans l&#39;agarose d&#39;un plat de dissection, couper les derniers 0,5 cm de l&#39;inflorescence et le coller verticalement dans l&#39;agarose. Le resteboutons de fleurs doivent être au-dessus de la surface d&#39;agarose. </li><li> Remplissez le plat d&#39;imagerie avec l&#39;eau stérile désionisée de sorte que le sommet des pousses est complètement immergé. Placer le plat de dissection au microscope stéréoscopique, et enlever l&#39;air emprisonné autour de l&#39;apex de la tige en créant des jets d&#39;eau avec une pipette de 1000 ul (figure 1, comparez C et D). </li><li> Sous la loupe binoculaire, utilisez la pince pour enlever les bourgeons de fleurs qui ne sont pas à imager en poussant sur la base du pédoncule ou le haut du bourgeon jusqu&#39;à la rupture de pédoncules (figure 1E). Il est important que les pédoncules cassent proprement à la jonction avec la tige, comme pédoncules restes empêchent l&#39;enlèvement des jeunes bourgeons floraux. </li><li> Si imagerie seulement boutons de fleurs de stade 5 et plus jeune (figure 2A), éliminer l&#39;eau avant de disséquer stade 6-8 bourgeons de fleurs. Si les bourgeons de fleurs d&#39;imagerie en scène 5 et plus, procéder à l&#39;ablation sépales (voir rubrique 5.1). Dans le cas contraire, proCeed à l&#39;étape 3.7. </li><li> En utilisant des pinces, percer un trou vertical dans le milieu d&#39;un plat de formation d&#39;image, et coller le sommet disséqué en position verticale dans le milieu, de sorte que seul le méristème apical des pousses et entourant les boutons floraux sont au-dessus de la surface du support. Selon le bourgeon de fleur (s) sont à imager, il peut être nécessaire d&#39;incliner légèrement l&#39;échantillon, comme les boutons floraux sont orientés comme pas nécessairement exactement la tige (figure 2A). </li><li> Procéder à la coloration de l&#39;échantillon si nécessaire. Dans le cas contraire coloration et / ou l&#39;imagerie de l&#39;échantillon tout de suite, ajouter de l&#39;eau et de fermer le plat d&#39;imagerie pour prévenir la déshydratation. En cas d&#39;utilisation d&#39;un microscope inversé, placer la capsule d&#39;imagerie dans une boîte en plastique transparent et la refermer. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig1.jpg" /> Figure 1: Préparation des pousses pour apex imagerie confocale en direct. (A - E) Dissection d&#39;untirer sur le sommet pour l&#39;imagerie. Inflorescences avant (A) et après (B) l&#39; élimination des siliques et des fleurs plus. (C - D) apex de la tige immergée dans l&#39; eau dans le plat de dissection, d&#39;une bulle d&#39;air emprisonnée à l&#39;extrémité (C) et après le retrait de la bulle d&#39;air (D). (E) Tirez sommet dans le plat disséquer, après dissection des bourgeons de fleurs de plus de stade 5. (F - G) Vue sur les sommets des pousses dans le plat d&#39;imagerie, sur la scène d&#39;un montant (F) et inversé (G) microscope confocal . Dans (F), une lentille d&#39;immersion de l&#39; eau 40X est positionnée au-dessus de l&#39; un des sommets, avec la pointe de la lentille immergée dans l&#39; eau. En (G), l&#39;apex de la tige est positionnée à l&#39; envers au-dessus de la lentille à immersion d&#39;eau 40X, avec une colonne d&#39;eau reliant le moyen de formation d&#39;image à l&#39;extrémité de la lentille. Le panneau inférieur en (F) montre une higsa vue en agrandissement de la zone dans le rectangle rouge, avec un apex de la tige insérée dans un milieu de formation d&#39;image; lignes rouges et bleues indiquent la surface du support et de l&#39;eau, respectivement. (H - I) Des exemples de dispositifs sur mesure qui permettent d&#39; ajouter plus d&#39; eau à l&#39;extrémité de la lentille à immersion dans l&#39; eau: un manchon de caoutchouc de silicone fabriqué à partir d&#39; une cosse de bougie d&#39;allumage (H), et un manchon de fortune fabriqué à partir du doigt d&#39;un gant en latex poudrés (G). Les barres d&#39;échelle = 0,5 cm de (A) et (B), 0,1 cm de (C) et (D), et 100 um (E). Ce chiffre a été initialement publié en référence 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 4. Staining REMARQUE: Les parois cellulaires ou les membranes plasmiques peuvent être colorées avec de l&#39;iodure de propidium ou FM4-64, respectivement, pour parvenir à une résolution cellulairelors de l&#39;imagerie. En variante, les lignes de rapporteurs fluorescents marqués avec des protéines sur la membrane de plasma peuvent être utilisées 6, 16. <ol><li> Enlever l&#39;eau de la boîte d&#39;imagerie, et de garantir la surface du support est sec pour éviter la dilution du colorant. </li><li> Sous la loupe binoculaire, appliquer 20 à 30 pi de 1 mg / ml de solution d&#39;iodure de propidium, ou 80 pg / ml de solution FM4-64 au sommet disséqué avec une pipette 10 ul. Assurez-vous que l&#39;ensemble de l&#39;échantillon est couvert de colorant pour assurer une coloration homogène. </li><li> Colorer pendant 2 min si l&#39;on utilise l&#39;iodure de propidium, ou 20 min en cas d&#39;utilisation FM4-64. </li><li> Rincer deux fois avec de l&#39;eau stérile déminéralisée. </li></ol> 5. sépales Ablation NOTE: À l&#39;étape 4, sépales primordia commencent à couvrir le FM. Comme ils se développent, ils filtrent la fluorescence du tissu sous-jacent, et entravent le processus d&#39;imagerie. Sépales peuvent soit être enlevés manuellement à l&#39;aide d&#39;une broche métallique Mounted sur un axe-étau, ou empêché de se développer en utilisant une ablation au laser sur les nouveaux primordia sépales. Sinon, il est possible dans certains cas , d&#39;utiliser des mutants tels que apetala1-1, dans lequel sépales sont manquants ou remplacés par des feuilles ressemblant à des organes qui ne couvrent pas la FM tandis que la partie centrale de la fleur se développe normalement (figure 2F) 17. <ol><li> Ablation sépale sur les boutons floraux au stade 5 ou plus en utilisant un étau de broche tenant une aiguille métallique droite (Figure 2, E1-E2) <ol><li> Placez le plat disséquant avec le sommet disséqué sous la loupe binoculaire, et régler le grossissement au maximum. Immerger le sommet de la pousse dans l&#39;eau stérile, déminéralisée, ou encore, utiliser une pipette de 1000 pi à appliquer de l&#39;eau au sommet de la pousse régulièrement en disséquant les sépales. </li><li> Avec la goupille-étau, positionner la broche au-dessus des sépales abaxial, tangentiellement par rapport au sommet de la pousse. Poussez doucement sépales loin du sommet de la pousse jusqu&#39;à ce qu&#39;il se détacheà partir du bourgeon de fleur. </li><li> Procédez de la même avec sépales adaxial, mais pousser sépales vers le sommet des pousses. </li><li> Procédez de la même avec les sépales latéraux, mais positionner la broche radialement par rapport au sommet de la pousse, et pousser les sépales sur le côté, loin du bourgeon de fleur. </li><li> Immerger le sommet de la pousse dans l&#39;eau stérile déminéralisée pendant quelques minutes pour prévenir la déshydratation. </li></ol></li><li> L&#39; ablation laser de primordia sépale à l&#39; étape 3-4 (Figure 2, C5-D5) <ol><li> Placez le plat d&#39;imagerie avec le tachée, sommet disséqué sur la scène du microscope confocal. Localiser et de se concentrer sur le sommet que si la préparation de l&#39;image (voir la section 6, « Configuration d&#39;imagerie »). </li><li> En utilisant le logiciel du système d&#39;ablation laser, définir la zone d&#39;ablation, ce qui correspond à la crête et la pointe du primordia sépales émergents avant qu&#39;ils ne commencent à couvrir le méristème de fleurs (en général, à l&#39;étape 3 pour sépales abaxiales et adaxiales, et à un stade avancé 3 / début étape 4 pour se latéralcopains). </li><li> Réglez la puissance du laser et le temps de logement aux paramètres appropriés pour ablatent suffisamment de cellules sans infliger trop de dommages aux tissus sous-jacents. En règle générale, en fonction du système d&#39;ablation laser utilisé, les paramètres appropriés doivent d&#39;abord être identifiés par un processus d&#39;essais et d&#39;erreurs pour faire en sorte que suffisamment de cellules sont éliminées pour éviter que les sépales de se développer par la suite sur la FM, sans affecter le reste de la fleur bourgeon. En utilisant trop de puissance du laser et des logements résultats en temps en dommages au centre de la fleur, affectant la croissance et / ou la survie. Une fois que les paramètres appropriés ont été identifiés, ils peuvent être réutilisés pour des expériences ultérieures. NOTE: Si l&#39;ablation initiale se révèle insuffisante, il est possible de procéder à une deuxième ablation les jours suivants (figure 2, C4 et D2). </li></ol></li></ol> 6. Configuration Imaging <ol><li> Utilisez un microscope droit. <ol&gt; <li> Remplir la coupelle de formation d&#39;image avec les sommets disséqués avec de l&#39; eau stérile, désionisée de sorte que la surface du support est recouverte d&#39;eau de 2,5 à 5 mm (figure 1F). Complètement immerger les échantillons. REMARQUE: Lors de l&#39;imagerie avec un microscope droit, plusieurs sommets peuvent être placés dans le même plat d&#39;imagerie. Toutefois, si le processus d&#39;imagerie dure plus d&#39;une heure, l&#39;iodure de propidium a tendance à diluer, et quelques échantillons pourrait avoir besoin re-coloration avant l&#39;imagerie. </li><li> Placer le plat d&#39;imagerie sur la platine du microscope (Figure 1F). Abaisser la lentille par immersion d&#39;eau et d&#39;élever la scène de telle sorte que la pointe de la lentille plonge dans l&#39;eau. Procéder avec précaution afin de ne pas écraser les sommets disséqués ou tremper la lentille dans le milieu de formation d&#39;image. </li><li> Si une bulle d&#39;air est emprisonné à la pointe de la lentille, faire des jets d&#39;eau avec une pipette de 1000 pi pour le retirer. </li><li> Sous illumination par épifluorescence, la position un des sommets disséqués dans le champ de la lentille à l&#39;aide du XY conTroller. Regardez à travers les Oculaires et se concentrer sur l&#39;échantillon en utilisant le contrôleur Z. Faire preuve de prudence afin de ne pas écraser l&#39;échantillon. </li><li> En utilisant le logiciel de microscope confocal, zoom sur le bouton de fleur à imager, et procéder à l&#39;imagerie de votre échantillon. </li></ol></li><li> Utilisation d&#39; un microscope inversé. <ol><li> En utilisant une pipette de 1000 pi, mettre une goutte d&#39;eau stérile, déminéralisée à la pointe de la lentille. </li><li> Tenez le plat d&#39;image à l&#39;envers, et avec une pipette de 1000 pi, ajouter une goutte d&#39;eau stérile, déminéralisée au sommet disséqué. </li><li> Placer le plat de formation d&#39;image à l&#39; envers sur la platine du microscope (figure 1G). Faire preuve de prudence afin de ne pas écraser l&#39;échantillon. </li><li> Sous éclairage à épifluorescence, positionner le sommet disséqué sur la pointe de la lentille à l&#39;aide du contrôleur XY. Avec le contrôleur de Z, abaisser soigneusement l&#39;étape jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon atteigne la goutte d&#39;eau à l&#39;extrémité de la lentille. Une colonne d&#39;eau doit former between l&#39;extrémité de la lentille et du milieu. </li><li> Si la colonne d&#39;eau ne forme pas, ajouter soigneusement une goutte d&#39;eau à l&#39;échantillon avec une pipette de 1000 pi. Ajouter des manches de fortune à la lentille afin d&#39;ajouter plus d&#39; eau à son extrémité, ce qui facilite la mise en place et le maintien de la colonne d&#39;eau (Figure 1H et 1I). </li><li> Sous l&#39;éclairage de épifluorescence, regarder à travers les Oculaires et se concentrer sur l&#39;échantillon en utilisant le contrôleur Z. Faire preuve de prudence afin de ne pas écraser l&#39;échantillon. </li><li> En utilisant le logiciel de microscope confocal, zoom sur le bouton de fleur à imager, et procéder à l&#39;imagerie de l&#39;échantillon. </li></ol></li><li> Si vous effectuez des expériences de laps de temps, verser l&#39;eau sur le plat d&#39;imagerie et le fermer pour prévenir la déshydratation entre des points de temps. Placer le plat de formation d&#39;image avec les échantillons dans longue journée (16 h de lumière) ou le jour en continu, 16-22 ° C conditions. échantillons reteindre avant chaque point de temps. REMARQUE: Alors que les cellules en déveping organes floraux peuvent se diviser plus rapidement, les cellules de la fracture florale méristème une ou deux fois tous les deux jours, et les lignées cellulaires sont faciles à suivre avec des points de temps toutes les 24 h. Cependant, le cas échéant, il est possible de l&#39;image des échantillons toutes les six heures. </li></ol> 7. Considérations sur les paramètres d&#39;imagerie NOTE: Comment configurer les paramètres d&#39;imagerie dépend beaucoup du système confocal utilisé. Voici quelques suggestions pour certains de ces paramètres qui peuvent être utilisés avec un microscope confocal. Pour plus de considérations sur les paramètres d&#39;imagerie, voir la section Discussion et référence 14. <ol><li> Pour la résolution XY: utiliser x 1,024 1,024 pour une bonne résolution cellulaire. Vous pouvez également utiliser 512 x 512 pour réduire le temps d&#39;imagerie, au détriment de la résolution. </li><li> Pour la résolution de Z: régler l&#39;étape de taille de 0,5 à 1,5 pm. L&#39;abaissement de l&#39;étape de taille augmente la résolution de Z mais aussi le temps de formation d&#39;image. </li><li&gt; Pour le sténopé: régler le sténopé à 1-1,5 unités aérées. L&#39;augmentation du sténopé augmente l&#39;intensité du signal, mais aussi le bruit des avions non-focaux. </li></ol> 8. Visualisation des données confocale <ol><li> Tourner les images fixes de points de temps de développement des fleurs dans un film. <ol><li> Ouvrez les images fixes (en format JPEG ou TIF) dans le logiciel (par exemple, FIDJI). </li><li> Aller à l&#39;image&gt; Stacks&gt; Images à Stack. Les images ouvertes seront regroupées dans une pile. </li><li> Si l&#39;ordre des images de la pile ne correspond pas à l&#39;ordre chronologique, utilisez le plugin Stack Sorter (plug-ins&gt; Piles&gt; Stack Sorter) pour les réorganiser. </li><li> Pour activer la pile dans un film, allez dans Fichier&gt; Enregistrer sous&gt; AVI. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Prunet, N., Jack, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flower+Development+in+Arabidopsis:+There+Is+More+to+It+Than+Learning+Your+ABCs.">Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).</li><li>Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+regulatory+mechanisms+controlling+floral+organ+development.">Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development.</a> FEBS J. , (2016).</li><li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+auxin+transport+and+gene+expression+during+primordium+development+revealed+by+live+imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem.">Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).</li><li>Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell+homeostasis+and+growth+dynamics+can+be+uncoupled+in+the+Arabidopsis+shoot+apex.">Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex.</a> Science. 310 (5748), 663-667 (2005).</li><li>Yadav, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WUSCHEL+protein+movement+mediates+stem+cell+homeostasis+in+the+Arabidopsis+shoot+apex.">WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex.</a> Genes &amp; Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).</li><li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana.">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).</li><li>Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DORNROSCHEN-LIKE+expression+marks+Arabidopsis+floral+organ+founder+cells+and+precedes+auxin+response+maxima.">DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima.</a> Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).</li><li>Urbanus, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+localisation+patterns+of+MADS+domain+proteins+during+floral+development+in+Arabidopsis+thaliana.">In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 9, (2009).</li><li>Hong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+Cell+Growth+Yields+Reproducible+OrganDevelopment+through+Spatiotemporal+Averaging.">Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging.</a> Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).</li><li>Roeder, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+the+control+of+cell+division+underlies+sepal+epidermal+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).</li><li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem.">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).</li><li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Lineage+Analysis+to+Study+Cell+Division+Orientation+in+the+Arabidopsis+Shoot+Meristem.">Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li><li>Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds.">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Dev. Biol. , (2016).</li><li>Fernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+plant+growth+in+4D:+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution.">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. , (2010).</li><li>Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+GFP::cDNA+fusions+enable+visualization+of+subcellular+structures+in+cells+of+Arabidopsis+at+a+high+frequency.">Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).</li><li>Irish, V. F., Sussex, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+apetala-1+gene+during+Arabidopsis+floral+development.">Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development.</a> Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).</li><li>Vernoux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin+signalling+network+translates+dynamic+input+into+robust+patterning+at+the+shoot+apex.">The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex.</a> Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators.">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li><li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoGraphX:+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D.">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864 (2015).</li><li>Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell+shape+and+gene+expression+in+the+shoot+apical+meristem+using+MorphoGraphX.">Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX.</a> Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).</li></ol>

L&#39;auteur n&#39;a rien à divulguer.

Nous présentons ici un protocole pour l&#39;imagerie des vivants, développement des boutons floraux Arabidopsis avec un microscope confocal et une lentille d&#39;eau par immersion. Même si cela peut être fait avec soit un montant ou d&#39;un microscope inversé, il est plus facile et plus rapide d&#39;utiliser l&#39;ancien. Il est également intéressant de noter que les différents systèmes de confocale varient considérablement en termes de vitesse, sensibilité et capacité à séparer les longueurs d&#39;onde. Les meilleurs microscopes confocaux permettent maintenant de l&#39; image de plusieurs canaux différents (par exemple , GFP, YFP, DsRed et l&#39; iodure de propidium, la figure 2G) dans les mêmes échantillons. Certains microscopes confocale sont équipés d&#39;un détecteur spectral, qui peut recueillir la fluorescence de plusieurs fluorophores simultanément et de les séparer par la suite. Lors de l&#39;utilisation d&#39;un détecteur régulier, cependant, un ensemble de lasers et les filtres doivent être utilisés pour exciter et séparer la fluorescence de fluorophores différents. Certains fluorophores ont des spectres d&#39;émission totalement distinctes (par exemple CFP und YFP), et peut être imagée simultanément. D&#39; autres fluorophores ont des spectres d&#39;émission se chevauchant partiellement (par exemple , GFP et YFP), et ont généralement besoin d&#39;être imagé séparément, ce qui augmente le temps de formation d&#39;image. L&#39;imagerie fluorophores également à proximité nécessite souvent limiter la quantité de spectre est recueilli pour chaque canal pour empêcher la fluorescence d&#39;un fluorophore de fuir dans un autre canal. Cela provoque une perte d&#39;intensité du signal recueilli, qui peut être compensée par une augmentation de la puissance laser et le gain. Cependant, le temps de formation d&#39;image prolongée et une augmentation de la puissance du laser peut décolorer et / ou endommager l&#39;échantillon. Augmentation de la puissance du laser et / ou le gain peut également augmenter le bruit de fond. L&#39;optimisation de l&#39;intensité du signal, la résolution et le temps de formation d&#39;image pour chaque échantillon se fait par un processus d&#39;essais et d&#39;erreurs, et implique des compromis permanents. Ce protocole explique comment effectuer l&#39;imagerie confocale en direct des bourgeons floraux en développement sur les flancs d&#39;un sommet de la pousse disséqué. Ilpeut faire valoir que le fait que le sommet de la pousse n&#39;est pas relié au reste de la plante et se développe dans un milieu contenant cytokinines pourraient affecter SAM et le développement des fleurs. Cependant, ce milieu a été conçu de façon empirique par un processus d&#39; essais et d&#39;erreurs pour assurer le méristème apical pousse disséquée produisent de nouveaux bourgeons de fleurs à la plastochrone normale, et que ces bourgeons floraux se développent normalement 15. De même, la dissection sépales ne semble pas affecter les profils d&#39;expression des gènes ou le développement du reste de la fleur. D&#39; autres protocoles détail comment réaliser une imagerie confocale en direct du SAM toujours attaché au reste de la plante (par exemple , référence 11). Ces protocoles pourraient être adaptés, et offrent une alternative intéressante pour l&#39;imagerie du développement des fleurs, en particulier lors de l&#39;étude des processus liés cytokinines. Ils présentent plusieurs inconvénients cependant: les tiges et allonge tord, et modifie l&#39;orientation des bourgeons de fleurs; unend tandis que l&#39;image d&#39;une pointe de tournage attaché au reste de la plante fonctionne bien avec un microscope droit, il est beaucoup plus compliqué de le faire avec un microscope inversé. Les lentilles d&#39;immersion ont une meilleure ouverture numérique (NA) de lentilles « secs » ( à savoir les lentilles qui sont séparées de l&#39;échantillon par l&#39; air), et fournissent donc une résolution plus fine de l&#39;échantillon, ce qui est essentiel pour l&#39;utilisation d&#39; un microscope confocal. En utilisant une lentille à immersion d&#39;eau fournit ainsi une bien meilleure NA qu&#39;un objectif à sec, tout en empêchant le sommet des pousses de se déshydrater pendant le processus d&#39;imagerie. Bien que la glycérine et les lentilles d&#39;huile ont une NA que les lentilles d&#39;eau, ils ont besoin encore plus l&#39;utilisation d&#39;une lamelle, ce qui est très peu pratique avec un échantillon de la taille d&#39;un sommet de la pousse, qui maintient également de plus en plus au cours des expériences en accéléré. Compte tenu de la taille des échantillons (en fonction des étapes de fleurs, les piles peuvent être de plus de 150 pm d&#39;épaisseur), il est également important d&#39;utiliser une lentille à longue distance de travail. Nous utilisons généralement une lentille 20 ou 40X avec un NA de 1 et une distance de travail de 1,7-2,5 mm. Logiciel de microscope confocal offre plusieurs façons de visualiser les données confocale, y compris les reconstructions en trois dimensions (figure 2, B1, B2 et B4) et vue sur la tranche (Figure 2, B3). Alors que les plus couramment utilisés des vues en trois dimensions sont des projections d&#39;intensité maximale des Z-piles confocale (figure 2, B1 et B4), un logiciel (par exemple ZEN et Imaris) offrent également une vue sur la transparence qui filtre le signal provenant des parties les plus profondes de l&#39;échantillon (figure 2, B2), qui peut être utile quand on regarde les processus qui se déroulent, ou des gènes exprimés dans la couche épidermique. L&#39; intensité du signal peut être soit codée avec une couleur unique (figure 2, B1), en utilisant des pixels intensity, ou en utilisant un code de couleur (figure 2, B4). imagerie confocale en direct offre non seulement des informations qualitatives précieuses sur le développement des fleurs, il fournit également potentiellement les biologistes du développement avec une richesse de données quantitatives. Logiciels différents (par exemple Imaris, FIDJI, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) permet la quantification du nombre ou du volume des cellules exprimant une ou plusieurs reporters, ou le niveau d&#39;expression d&#39;un rapporteur dans des cellules différentes. Un tel logiciel peut également être utilisé pour effectuer la segmentation automatique des cellules, le suivi des lignées cellulaires et de quantifier la croissance. Ce logiciel offre des outils différents semblables, mais diffère également à bien des égards. MARS-ALT et MorphoGraphX ont été conçus spécialement pour les plantes 15, 20, 21, contrairement à un Imarisnd FIDJI. MorphoGraphX ​​ne permet que la segmentation et l&#39;analyse de la couche épidermique, alors que Imaris et MARS-ALT permettent la segmentation et l&#39;analyse de l&#39;ensemble de l&#39;échantillon. Cependant, MARS-ALT nécessite l&#39;imagerie préalable du même échantillon sous trois angles différents de 15, et Imaris ne nécessite qu&#39;une seule pile. L&#39;accès à l&#39;information quantitative est essentielle pour approfondir notre compréhension du développement des fleurs.

La majeure partie du corps de la plante forme post-embryonnairement des groupes de cellules souches situées à ou près de la pointe - ou méristème apical - des pousses et des racines. Toutes les structures hors-sol de la plante adulte dérivent du méristème apical de la tige (SAM), qui produit en permanence des organes latéraux sur ses flancs: feuilles pendant la phase végétative, et méristèmes de fleurs (fms) après sa transition vers la phase de reproduction. FMs à son tour se transforment en fleurs. Bien que le produit Arabidopsis SAM organes latéraux une à la fois, dans un motif en spirale itératif, FMS produisent quatre types d&#39;organes floraux dans les quatre verticilles, de façon partiellement synchrone, avec de multiples programmes de développement démêler simultanément. Les réseaux génétiques qui sous - tendent la spécification de l&#39;identité des différents organes floraux ont été partiellement déchiffré (pour des revues, voir les références 1, 2), mais de nombreux aspects de dével de fleursnt, tels que le positionnement d&#39;organes floraux et la définition des frontières entre les verticilles, restent mal compris. Les premières études génétiques moléculaires de développement des plantes principalement fondé sur des techniques telles que l&#39;hybridation in situ et les journalistes GUS pour analyser l&#39; expression génique. Bien que ces méthodes ont fourni une mine d&#39;informations et a grandement contribué à notre compréhension de la croissance des plantes et le développement des fleurs, il y a des limites importantes: ils manquent une bonne résolution cellulaire, ne permet pas l&#39;observation facile du motif d&#39;expression de plusieurs gènes dans le même échantillons, et surtout, ne peuvent être appliquées aux morts, des tissus fixes. Les progrès récents en microscopie confocale ont réussi à surmonter ces limitations, et de fournir des biologistes du développement d&#39;un outil puissant pour étudier les processus morphogenèse végétale sous-jacente. En particulier, la microscopie confocale permet l&#39;observation des tissus vivants et organes tout au long de leur formation, ce qui est critical pour comprendre un processus dynamique par excellence comme le développement. Imagerie confocale en direct a été largement utilisé pour analyser la croissance aérienne des plantes et la production d&#39;organes latéraux par le SAM (par exemple des références 3, 4, 5, 6), mais à l&#39;exception de quelques rapports (par exemple les références 7, 8, 9, 10), il n&#39;a pas été largement appliquée à l&#39;étude du développement des fleurs. Protocoles pour l&#39; imagerie confocale en direct du SAM sont disponibles (par exemple les références 11, 12), et de fournir une bonne base pour savoir comment l&#39; image des bourgeons en développement de fleurs qui entourent le SAM. Cependant, les bourgeons de fleurs d&#39;imagerie présente des défis spécifiques: par exemple,bourgeons de fleurs deviennent rapidement plus grand que le SAM, et à l&#39; étape 4, sépales commencent à couvrir les FM (étapes comme décrit dans la référence 13), et la variation de la fluorescence des tissus sous - jacents (figure 2A). Ici, nous fournissons un protocole détaillé expliquant comment effectuer l&#39;imagerie confocale en direct sur le développement des bourgeons de fleurs Arabidopsis en utilisant soit un montant ou d&#39;un microscope inversé et une lentille à immersion d&#39;eau. Nous avons publié précédemment ce protocole en référence 14.

<table><tbody><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-D</td><td>Dumont Style 5 Inox, for apex dissection</td></tr><tr><td>Pin Vise</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13560</td><td>80 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Straight Stainless Steel Needles&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13561-50</td><td>0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Round plastic boxes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64332</td><td>transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes</td></tr><tr><td>Rectangular hinged boxes</td><td>Durphy Packaging Co.&amp;nbsp;</td><td>DG-0730</td><td>transparent, 2-7/8&amp;rdquo; long, 2&amp;rdquo; wide, 1-1/4&amp;rdquo; deep, to use as imaging dishes with an upright microscope</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td><td>VWR</td><td>25382-064</td><td>transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope</td></tr><tr><td>P10 and P1000 pipettes&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>with corresponding filter tips</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>with an 80-90X maximum magnification</td></tr><tr><td>Laser ablation system</td><td></td><td></td><td>for sepal ablation</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 or 40X water-dipping lens</td><td></td><td></td><td>with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog basic salt mixture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>without vitamins</td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0761</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Pyridoxine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6280</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Thiamine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>N6-Benzyladenine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td>BAP, a cytokinin</td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td>dilute in water to 80&amp;nbsp;&amp;mu;g/mL, to stain the plasma membranes</td></tr></tbody></table>

live confocal imaging of developing arabidopsis flowers

L&#39;étude de la croissance des plantes et le développement a longtemps reposé sur des techniques expérimentales utilisant des tissus morts, fixes et sans une résolution cellulaire appropriée. Les progrès récents en microscopie confocale, combinées avec le développement de nombreux fluorophores, ont réussi à surmonter ces problèmes et a ouvert la possibilité d&#39;étudier l&#39;expression de plusieurs gènes en même temps, avec une bonne résolution cellulaire, dans des échantillons vivants. imagerie confocale en direct fournit phytobiologistes un outil puissant pour étudier le développement, et a été largement utilisé pour étudier la croissance des racines et la formation des organes latéraux sur les flancs du méristème apical. Cependant, il n&#39;a pas été largement appliquée à l&#39;étude du développement des fleurs, en partie en raison des défis spécifiques à l&#39;imagerie des fleurs, telles que les sépales qui poussent sur le méristème de fleurs, et filtrer la fluorescence des tissus sous-jacents. Nous présentons ici un protocole détaillé pour effectuer l&#39;imagerie confocale en direct sur en direct, le développement arabeidopsis boutons de fleurs, en utilisant soit un montant ou d&#39;un microscope inversé.

La figure 2 présente des vues différentes de Z piles confocales de boutons floraux d&#39;Arabidopsis vivants exprimant différents gènes rapporteurs fluorescents, et colorées avec soit de l&#39; iodure de propidium (figure 2, A-C5 et G) ou FM4-64 (Figure 2, E1-F) à fournir une résolution cellulaire claire. La plupart des systèmes confocaux permettent la formation d&#39; image de deux fluorophores avec des spectres d&#39;émission ne se chevauchent pas telles que la GFP ou YFP conjointement avec soit de l&#39; iodure de propidium ou FM4-64 (Figure 2A - 2F). Les meilleurs systèmes confocaux sont également capables de séparer plusieurs fluorophores avec des spectres d&#39;émission se chevauchant partiellement dans les mêmes échantillons, tels que la GFP et YFP et DsRed et l&#39; iodure de propidium (figure 2G). Trois exemples d&#39;expériences en accéléré sont présentés à la figure2 et montrent les boutons floraux se développer normalement après ablation sépale a été effectuée soit avec un système d&#39;ablation au laser (figure 2, alkyle en C1-C5 et D1-D5) ou manuellement avec une tige-étau et une tige métallique (Figure 2, E1-E2). Notez que le bourgeon de fleur montre la figure 2, E1-E2 est d&#39;une plante mutante superman-1, qui est la raison pour laquelle primordiums carpelles ne sont pas respectées au centre du bourgeon au stade 7. L&#39; ablation laser de primordia sépales émergent du bourgeon de fleur représenté sur la figure 2, alkyle en C1-C5 qui les empêche de recouvrir la FM, qui peut encore être imagé à l&#39; étape 5 (Figure 2, C5). A l&#39; inverse, dans le cas du bourgeon de fleur montre la figure 2, D1-D5, l&#39; ablation laser seulement retardé la croissance des sépales, mais sépales finit par se couvrir la majeure partie du FM par étape 5 (Figure 2, D5 </strong&gt;). Au contraire, si trop de puissance laser et le temps d&#39;habitation est utilisé lors de l&#39;ablation laser, les dommages se propage à la partie centrale de la fleur et affecte sa croissance et aboutit parfois à la mort subséquente de l&#39;ensemble des boutons floraux. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig2.jpg" /> Figure 2: Visualisation des Z-piles confocale de bourgeons de fleurs vivantes. A et B2 sont des vues de transparence; B1 et B4-G sont des projections d&#39;intensité maximale; B3 est une vue en coupe orthogonale. (A - E2) des fleurs exprimant un reporter de Vénus du gène APETALA3 (vert); parois cellulaires ont été colorées avec de l&#39; iodure de propidium (rouge, à l&#39; exception de B4, vert). (A) Inflorescence; chiffres indiquent les étapes florales; sépales au stade 4 et 5 fleurs filtrer la fluorescence du reporter Vénus, qui normalement enforterms un anneau. Notez que certains boutons de fleurs apparaissent inclinées par rapport à l&#39;inflorescence. (B1 - B4) Quatre vues différentes de la même Z-stack confocale d&#39;un étage 5 bourgeon de fleur: projections d&#39;intensité maximale (B1 et B4) avec une intensité de signal Venus codé avec une intensité de pixel pour la couleur verte (B1) ou avec le code de couleur du feu (B4; un code de couleur est indiquée au bas du tableau); vue en transparence (B2) et vue sur la tranche orthogonale (B3; l&#39;orientation XY, XZ et YZ des tranches est indiquée dans le tableau). (C1 - C5) 4 jours time-lapse d&#39;un bourgeon de fleur individuelle de l&#39; étape 3 à l&#39; étape 5; ablation laser (marqués comme des traits blancs) effectuées le jour 1 et le jour 3 étaient suffisantes pour empêcher les sépales de couvrir le centre du bouton floral au stade 5. (D1 - D5) 4 jours time-lapse d&#39;un bourgeon de fleur individuelle de étape3 à l&#39;étape 5; ablation laser effectuées le jour 1, 2 et 3 étaient insuffisants pour empêcher les sépales de couvrir le centre du bouton de fleur. (E1 - E2) de bourgeon de fleur individuelle après le retrait manuel du sépales abaxial et adaxiales (E1) et de tous les sépales (E2); blancs indiquent les pointes de flèches sépales restantes; astérisques blancs indiquent les cicatrices résultant de la suppression des sépales. (F) l&#39; étape 7 de la fleur apetala1-1 exprimant un reporter DR5-3xVenusN7 18 (vert); Les membranes de plasma ont été colorées avec FM4-64 (rouge); bleu indiquent les pointes de flèche des structures semblables à des feuilles qui remplacent les sépales et ne couvrent pas le bourgeon de fleur. (G) des boutons floraux Etape 4 exprimant un reporter de GFP fluorescente pour Dornroschen DE TYPE 7 (vert), reporter Venus pour SUPERMAN (rouge) et un rapporteur DsRed pour CLAVATA3 19 (cyan); cellulesles parois ont été colorées avec de l&#39;iodure de propidium (gris). d: jour; st: scène. Les barres d&#39;échelle = 25 pm; échelle est identique à B1, B2 et B4, en C1-C5 et D1-D5. Ce chiffre a été modifié de la référence 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers at JoVE.com

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

imagerie confocale en direct fournit aux biologistes un outil puissant pour étudier le développement. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l&#39;imagerie confocale en direct de développer des fleurs Arabidopsis.

Vivre imagerie confocale de développement Arabidopsis Fleurs

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

live-confocal-imaging-of-developing-arabidopsis-flowers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.8K vues.  California Institute of Technology.  imagerie confocale en direct fournit aux biologistes un outil puissant pour étudier le développement. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l'imagerie confocale en direct de développer des fleurs Arabidopsis. 

Vidéo: Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Inductible, Expression spécifique au Type cellulaire chez Arabidopsis thaliana médiation par le biais de LhGR Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Recherche

Génétique

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Biologie du développement

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Imagerie confocale direct des méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

Imagerie cellulaire en direct du cytosquelette microtubule et manipulation micromécanique de l’Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Une méthode simple pour l&#39;imagerie Arabidopsis Feuilles utilisant perfluorodécaline comme un moyen d&#39;imagerie infiltratives

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Biologie

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Analyse cellulaire spécifique de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

À long terme, à haute résolution d&#39;imagerie confocal Time Lapse d&#39;<em&gt; Cotylédon Arabidopsis</emEpiderme&gt; cours de germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Mesure spatiale et temporelle Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux de plantes d&#39;Arabidopsis

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imagerie en temps réel des plantes Dynamics de surface cellulaire avec angle variable épifluorescence Microscopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Une méthode polyvalente pour le montage de Arabidopsis quitte pour l’imagerie Intravitale time-lapse

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Vivre imagerie confocale de développement Arabidopsis Fleurs

Résumé

Explorer plus de vidéos

Chapitres dans cette vidéo

Inductible, Expression spécifique au Type cellulaire chez Arabidopsis thaliana médiation par le biais de LhGR Trans-Activation

Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis

Imagerie confocale direct des méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes

Imagerie cellulaire en direct du cytosquelette microtubule et manipulation micromécanique de l’Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Une méthode simple pour l'imagerie Arabidopsis Feuilles utilisant perfluorodécaline comme un moyen d'imagerie infiltratives

Analyse cellulaire spécifique de

À long terme, à haute résolution d'imagerie confocal Time Lapse d'

Mesure spatiale et temporelle Ca

Imagerie en temps réel des plantes Dynamics de surface cellulaire avec angle variable épifluorescence Microscopie

Une méthode polyvalente pour le montage de Arabidopsis quitte pour l’imagerie Intravitale time-lapse