Puisque cette méthode détermine les cellules anticorps pd-1-bloquantes utilisant le sang périphérique des patients, le sous-ensemble spécifique responsable des effets antitumoraux et des événements défavorables immunisés-connexes peut être identifié. Cette méthode n’a besoin que d’une petite quantité d’échantillon de sang et le processus d’analyse est assez simple et rapide. Il a juste besoin d’une machine de cytométrie d’écoulement.
Pour commencer, prélever des échantillons de sang entier dans des tubes de collecte de sang contenant de l’EDTA. Traitez chaque tube de cytométrie de flux de polystyrène rond de cinq millilitres avec un millilitre de sérum bovin fœtal de 2 % dans le PBS. Vortex pendant 10 secondes.
Transférer ensuite 20 microlitres d’échantillons de sang entier vers les tubes ronds de fond traités de cinq millilitres. Ajouter 20 microlitres de 2%FBS dans PBS et 10 microlitres de récepteur FC spécifique à l’homme bloquant le réagent. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse de globule rouge. Bien mélanger et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Ajouter quatre millilitres de 2%FBS dans PBS et faire tourner les cellules à 400 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Retirez le surnatant par aspiration. Répétez le processus de lavage et d’aspiration. Resuspendez les cellules en 100 microlitres de 2%FBS dans PBS et divisez-les en deux tubes de 50 microlitres chacun.
Ajouter des anticorps marqueurs de surface. Bien mélanger et incuber pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Lavez les échantillons deux fois dans 2%FBS dans PBS comme précédemment.
Resuspendez les cellules dans 200 microlitres de 2%FBS dans PBS. Insérez les tubes dans le cytomètre d’écoulement et acquérez des cellules suivant le protocole recommandé. Enregistrez 10 000 événements comme la porte des lymphocytes et les données sur le flux d’exportation sous forme de fichiers FCS pour analyse.
Ouvrez les fichiers dans le logiciel d’analyse et cliquez sur le fichier de contrôle de l’isotype pour visualiser les cellules sur une parcelle de dispersion vers l’avant par rapport à la parcelle de dispersion latérale et les lymphocytes de porte. Sélectionnez les cellules individuelles à l’aide de FSCH versus FSCW et SSCH versus SSCW et affichez-les sur un CD3 contre CD8 ou CD3 par rapport à l’intrigue CD4. Portez les lymphocytes T CD8 et les lymphocytes T CD4 respectivement.
Sélectionnez les cellules fermées et affichez-les sur une parcelle PD-1 par rapport à l’intrigue humaine IgG4. Et puis basé sur le contrôle de l’isotype, sélectionnez Q3 pour identifier les lymphocytes CD8 et CD4 liés aux anticorps PD-1-bloquants. Dans cette étude, la stratégie de blocage et l’analyse de cytométrie de flux ont détecté la liaison d’anticorps pd-1-bloquant aux lymphocytes T obtenus à partir d’une goutte de sang périphérique patient.
L’intrigue PD-1 versus human IgG4 montre l’état contraignant des anticorps bloquant le PD-1 sur les cellules T. Les points orange et les points noirs indiquent des taches anticorps anti-IgG4 et de contrôle de l’isotype respectivement. Avant que l’anticorps pd-1-bloquant ait été administré, aucun CD8 positif d’IgG4 humain ou T-cells CD4 n’était présent et l’expression de PD-1 a été confirmée par un anticorps de détection de PD-1.
Après l’administration de nivolumab ou de pembrolizumab, IgG4 peut être détecté sur des T-cells par anticorps anti-IgG4 tandis que le PD-1 détectant l’anticorps EH12.1 ne reconnaît aucun PD-1 sur les T-cells. Les portes rouges, bleues et vertes indiquent une liaison complète, une liaison partielle et une perte de reliure respectivement. Après que les patients aient discontinué le nivolumab et le pembrolizumab, le statut de l’anticorps PD-1-bloquant se liant aux lymphocytes T CD8 a diminué.
Il y a eu une perte partielle contraignante et finalement complète de liaison. S’il vous plaît assurez-vous de mélanger l’échantillon de sang avec la lyse RBC ainsi. En outre, le mélange de la lyse RBC avant la coloration des marqueurs de surface est l’étape clé de cette méthode.
Si le chercheur a accès à une machine avancée de cytométrie de flux, les lymphocytes T pd-1-bloquants liés aux anticorps peuvent être évalués avec de plus en plus de marqueurs liés à cette stratégie peuvent être appliqués pour profiler les phénotypes de cellules T responsables des événements indésirables causés par les anticorps de blocage de PD-1. L’échantillonnage des patients présentant des événements indésirables développés est important pour évaluer l’utilité de cette stratégie.
