Ce protocole fournit des modèles PDAC in vivo reproductibles et immunocompétents adaptés aux études de génotype, de phénotype et de réponse aux médicaments. Le principal avantage de cette technique est sa capacité à aider à étudier la progression tumorale avec un microenvironnement tumoral biologique syngénique tout en maintenant la reproductibilité de l’expérience. Stefanie Barthel et Chiara Falcomata, toutes deux issues de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Commencez la préparation des cellules tumorales en lavant l’adénocarcinome canalaire pancréatique, ou cellules PDAC, cultivées dans un flacon de culture T75 avec une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Ajouter ensuite 0,5 millilitre de trypsine pendant cinq à 10 minutes pour se détacher de la fiole. Re-suspendre les cellules détachées dans 10 millilitres de DMEM avec 10% de sérum bovin fœtal, ou FBS, et 0,1% de pénicilline streptomycine avant de transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.
Centrifuger la suspension cellulaire à 200G pendant cinq minutes et aspirer le surnageant. Re-suspendre la pastille cellulaire dans du DMEM sans additifs, en fonction de la concentration finale requise des cellules pour injection. Comptez les cellules dans 10 microlitres de suspension cellulaire, en utilisant la chambre de Neubauer et calculez le nombre de cellules disponibles.
Transférer un millilitre de la suspension diluée, selon la concentration finale requise, dans un tube de 1,5 millilitre. Placez le tube sur un rotateur jusqu’à l’implantation pour empêcher l’agrégation cellulaire. Pour l’implantation orthotopique des cellules PDAC, appliquez une crème pour les yeux sur la souris analgosédée pendant que la souris dort.
Vérifiez l’analgosédation suffisante avant de raser le flanc abdominal latéral gauche de la souris analgosédée. Placez la souris, couchée sur le côté droit, sur un tapis chauffant stérile et collez les pattes à la surface. Portez de nouveaux gants et désinfectez-les.
À l’aide de ciseaux chirurgicaux, couper environ un centimètre de la peau et du tissu adipeux sous-cutané longitudinalement sur le flanc gauche où la rate est projetée. À l’aide de ciseaux et de forceps, séparez la peau du péritoine pour faciliter l’accès au péritoine. Changez la paire de ciseaux avant d’ouvrir le péritoine à l’emplacement de la rate avec une coupe longitudinale d’un centimètre.
Tout en mobilisant la rate et le pancréas attaché à l’aide d’une pince émoussée et à pointe fine, assurez-vous que les organes ne sont pas attachés à d’autres tissus. Vérifiez également les vaisseaux sanguins d’alimentation pour éviter de blesser les vaisseaux ou les tissus environnants lors de la manipulation du pancréas. Retirez soigneusement le pancréas de l’incision pour permettre un accès plus facile à la queue de l’organe et observez la rate après le pancréas.
Assurez-vous que l’organe n’est pas plié pendant l’injection et que la capsule de l’organe est maintenue sous tension au site de pénétration de l’aiguille pour éviter les déversements. Visez un morceau de tissu pancréatique entre les vaisseaux sanguins visibles pour minimiser le risque de perforation ou d’injection du vaisseau. À l’aide de la main dominante, pénétrez soigneusement dans la capsule de l’organe avec une canule de calibre 27 et une seringue de 50 microlitres en suivant l’axe longitudinal de l’organe.
Après avoir injecté les 20 microlitres de suspension contenant 2 500 cellules dans la région de la queue du pancréas, gardez le pancréas et la seringue insérée immobiles pendant environ une minute pour éviter de renverser les cellules tumorales. Ensuite, retirez l’aiguille du site d’injection. Ensuite, réorganisez soigneusement les organes à l’intérieur de l’abdomen sans blesser le tissu pour éviter de renverser les cellules.
Évitez l’adhérence des organes en versant un millilitre de chlorure de sodium à 0,9% sur les organes. Après avoir suturé le péritoine en utilisant la technique simple de suture interrompue, fermez la peau à l’aide de deux à trois clips enroulés en acier inoxydable de neuf millimètres. Antagoniser ensuite l’analgosédation avec le midazolam, la médétomadine et le fentanyl, ou MMF, avec une injection sous-cutanée d’AFN en fonction du poids corporel de la souris.
Une fois cela fait, placez la souris dans une chambre chauffée à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit éveillée et complètement active. Replacez la souris active dans sa cage d’origine et surveillez l’état de santé de la souris en vérifiant la fourrure, la couleur de la peau et l’activité, et répétez-la trois à quatre heures après la chirurgie. Dans l’IRM de souris implantée, la greffe de cellules PDAC a été palpée abdominalement le plus tôt environ sept jours après la chirurgie, en fonction du nombre de cellules injectées et des caractéristiques d’agressivité et de croissance de la lignée cellulaire inoculée.
La survie des souris implantées résultantes variait en fonction des caractéristiques intrinsèques des cellules tumorales des lignées cellulaires. Des injections intra-pancréatiques réussies ont conduit à des tumeurs à part entière dans le pancréas de souris. En revanche, les implantations infructueuses ont entraîné l’absence de tumeurs pancréatiques en raison de l’injection de cellules non viables, du rejet des cellules implantées ou de l’injection d’un nombre insuffisant de cellules.
N’oubliez pas de faire attention à ne pas renverser de cellules pendant les injections et à ne pas blesser les tissus environnants pour empêcher les cellules de se propager à l’intérieur de l’abdomen. Après cette procédure, des études in vivo, comme les études précliniques de réponse aux médicaments, peuvent être réalisées sur des souris immunocompétentes, suivies, par exemple, de faits, de séquençage ou d’analyses histologiques pour étudier les interactions tumeur-hôte.
