Ce protocole démontre l’expression et la purification des anticorps et la surveillance en temps réel de la distribution des anticorps dans la tumeur et les tissus. Le criblage des anticorps avec le protocole décrit aidera à sélectionner des anticorps qui ont la distribution non spécifique limitée de tissu, et enrichira des localisations de tumeur. La technique décrite est rapide et rentable.
D’autres techniques, telles que la tomographie calculée par émission d’un seul photon et la tomographie par émission de positons, sont très coûteuses et nécessitent des traceurs radioactifs et d’autres traceurs sophistiqués. La technique ne se limite pas aux anticorps ciblant le cancer. Il peut être appliqué à toute autre maladie, comme les maladies pulmonaires ou cardiaques, pour l’analyse de la distribution des anticorps dans le corps.
Jeremy Gatesman, un technicien vétérinaire de mon université, fera la démonstration de la procédure. Cellules CHO brutes dans 200 millilitres de médias, dans Delong, Erlenmeyer flacons déconcertés. Combinez cinq millilitres de cho freestyle media avec 50 microgrammes d’ADN variable de clone lourd, et 75 microgrammes un ADN variable de clone de lumière dans un tube de 15 millilitres.
Ensuite, vortex le tube. Laisser le mélange à température ambiante pendant cinq minutes. Ajouter 750 microlitres d’un milligramme par millilitre de stock de polyéthyllène à la solution d’ADN, et vortex agressif pendant 30 secondes.
Laisser le mélange à température ambiante pendant cinq minutes supplémentaires. Ajouter tout le mélange aux cellules CHO tout en secouant manuellement le flacon. Incuber immédiatement les cellules à 37 degrés Celsius tout en secouant à 130 RPM.
Le lendemain, ajouter deux millilitres de 100 X agent anti-agglutination, et deux millilitres de 100 X solution antibactérienne antimycotique aux cellules. Incuber les flacons à 32 à 34 degrés Celsius, avec des secousses à 130 RPM. Continuer à culturer les cellules pendant 10 à 11 jours, en ajoutant 10 millilitres d’alimentation Tryptone N1, et deux millilitres de supplément de glutamine 100 X tous les cinq jours.
Comptez les cellules tous les trois jours pour s’assurer que la viabilité cellulaire reste supérieure à 80 % Le jour 10 ou 11, récoltez le milieu pour la purification des anticorps en centrifugant la culture à 3 000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 40 à 60 minutes. Filtrez ensuite le média clair à l’aide d’un filtre à bouteille de 0,22 micromètre. Pour purifier les anticorps, équilibrer la colonne protéine A avec deux volumes de colonne de tampon liant.
Passez le média filtré à travers la colonne à la vitesse d’écoulement d’un millilitre par minute. Ensuite, lavez la colonne avec deux volumes de colonne de tampon de liaison. Utilisez cinq millilitres de tampon d’élitution pour émiguier l’anticorps en 500 fractions de microlitres.
Et neutraliser le pH de l’anticorps fait allusion en ajoutant 10 microlitres de tampon de neutralisation pour la fraction. Mesurer la concentration de l’anticorps purifié à l’aide d’un spectrophotomètre à l’aide du protocole par défaut pour IgG. Dialyze 0,5 millilitres de l’anticorps à l’aide d’une cassette de dialyse dans un litre de tampon de conjugaison.
Après quatre heures, transférer la cassette de dialyse dans un tampon frais et dialyser pendant la nuit. Pour mettre en place une réaction de conjugaison, ajouter 0,03 microgramme de colorant IRR 800 CWU par milligramme d’anticorps dans un volume total de 500 microlitres. Incuber le mélange pendant deux heures à 20 degrés Celsius, puis purifier les conjugués étiquetés par dialyse étendue contre PBS.
Estimer le degré d’étiquetage en mesurant l’absorption du colorant 780 nanomètres, et l’absorption de la protéine à 280 nanomètres. Pour développer des xénographes de souris, soulevez doucement la peau de l’animal et séparez-la de la couche musculaire sous-jacente. Injectez lentement 100 microlitres de suspension cellulaire sous la peau avec une aiguille de calibre 26.
Attendez quelques secondes avant de sortir l’aiguille afin que le milieu matriciel du sous-sol informe la structure semi-solide en forme de gel ainsi que les cellules sous la peau, ce qui empêchera le mélange de sortir du site d’injection. Pour effectuer l’imagerie in vivo, injectez l’anticorps étiqueté colorant par la veine de la queue. Après anesthésier la souris, vérifiez le manque de réponse aux réflexes de pédale, et dilatez la veine en appliquant de l’eau chaude.
Utilisez une seringue à insuline 1cc avec une aiguille de calibre 26 pour injecter 25 microgrammes de l’anticorps étiqueté dans un volume de 100 microlitres. Comme un contrôle négatif, étiqueter et injecter l’anticorps isotype IgG non spécifique qui ne cible pas les cellules cancéreuses. Effectuez l’imagerie in vivo huit, 24 et 48 heures après les injections d’anticorps.
Dans le logiciel d’imagerie, cliquez sur initialiser. Confirmez que la température de l’étape est de 37 degrés Celsius. Dans le panneau de contrôle, configurer l’imagerie par fluorescence par l’intermédiaire de l’assistant d’imagerie, et définir l’excitation à 773 nanomètres, émission à 792 nanomètres.
Transférer la souris anesthésiée dans la chambre d’imagerie. Placez-le sur le champ d’imagerie à l’aide du cône avant. Une fois prêt, cliquez sur acquérir sur le panneau de contrôle pour l’acquisition de l’image, et cliquez sur exposer automatiquement.
L’image générée est la superposition de la fluorescence sur l’image photographique avec fluorescence optique et densité affichées dans des unités de dénombrements ou de photons. Des clones positifs de cDNA avec les domaines lourds et variables variables de lumière ont été confirmés avec le PCR de colonie. Les résultats représentatifs de farletuzumab purifié exécuté sur la page de SDS non-réduisant et réduisant sont montrés ici.
Les chaînes lourdes et légères produisaient 50 et 25 bandes de kilodalton après réduction. La liaison des anticorps aux protéines indigènes dans la surface de cellules a également été confirmée. Les anticorps fluorescents étiquetés étaient la veine de queue injectée, dans les souris greffées avec les tumeurs pleines d’expression de R1.
Les animaux ont été vécus image à plusieurs moments en utilisant IVIS. les données confirs enrichissement sélectif des anticorps R1 et BaCa complets dans les tumeurs. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que le maintien des cellules CHO est essentiel pour le rendement des anticorps.
Et il est important d’avoir un degré semblable de conjugaison fluorescente de colorant pour la localisation compétitive de tumeur. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunohistochimie tissulaire et le tissu ou la tumeur spécifique ELISA peuvent être effectuées pour soutenir les données d’imagerie des souris vivantes.
