Les cellules synthétiques productrices de protéines offrent une plate-forme polyvalente pour étudier les origines de la vie ainsi que des thérapies synthétiques à base de cellules pour l’administration avancée de médicaments. Cette méthode est simple et abordable pour l’arn et l’expression des protéines et peut être appliquée pour la production thérapeutique sur place de protéines directement à l’intérieur du corps. Les systèmes peuvent être utilisés pour traiter un large éventail de maladies, des maladies métaboliques et des substituts protéiques au cancer et peut-être au diabète.
Ce protocole en plusieurs étapes a un point d’arrêt défini. Lors de l’exécution pour la première fois, il est recommandé de diviser l’œuvre sur plusieurs jours. Le protocole de production de cellules synthétiques commence par la préparation du lysate S30-T7 sans cellules.
Ensuite, les lipides membranaires et la solution nutritive cellulaire sont prêts à simuler l’environnement intérieur et à soutenir la production de protéines. La dernière étape est la préparation des cellules synthétiques elles-mêmes. Préparez des cultures de démarrage en double dans des flacons Erlenmeyer de 100 millilitres.
À chaque flacon, ajouter cinq millilitres de média LB complétés de 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline et inoculer avec une seule colonie d’E.coli. Cultivez la culture du jour au lendemain dans un shaker d’incubateur de plancher à 250 rpm et 37 degrés Celsius. Ensuite, préparez deux flacons Erlenmeyer déconcertés de litres contenant 500 millilitres de liquide tuberculeux complétés par 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline.
Inoculer chaque flacon de deux litres avec une culture de démarrage de cinq millilitres. Placer les flacons dans un shaker à 250 r/h et 37 degrés Celsius. Surveillez périodiquement les cultures à l’aide d’un spectrophotomètre et cultivez les cultures jusqu’à oD600 entre 0,8 et un.
Pour induire l’expression de polymésase d’ARN T7, ajoutez à chaque flacon trois millilitres de 100 millimolar IPTG pour atteindre 0.6 millimolar. Continuer à cultiver les cultures jusqu’à od600 est d’environ quatre. Une fois que les cultures atteignent la densité optique désirée, transférez la suspension de chaque flacon d’Erlenmeyer en deux tubes de centrifugeuse stérilisés de 250 millilitres.
Centrifuger les tubes à 7000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnatant. Resuspendez chaque granulé en 250 millilitres de tampon de lysate S30 froid à l’aide d’un agitateur si désiré.
Centrifugeuse à 7000 fois g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendez toutes les granulés ensemble dans 15 millilitres de tampon de lysate S30 froid. Filtrer la suspension à l’aide de tampons de gaze.
Avant de passer à l’étape suivante, précooler les pointes en flacons de 1,5 millilitre qui seront nécessaires pour stocker le lysate. Homogénéiser la suspension deux fois. Utilisez une pression de travail de 15 000 PSI avec une pression d’air de quatre barres pour la rupture cellulaire.
Recueillir l’homogénéité. Ajouter 100 microlitres de 0,1 molaire DTT par 10 millilitres de la suspension homogénéisée. Centrifugeuse de la suspension à 24, 700 fois g à 30 minutes à quatre degrés Celsius.
La TNT et le chloroforme sont classés comme irritants et nocifs et doivent donc être traités avec soin. Le chloroforme utilisé plus tard dans le protocole doit être utilisé dans une zone d’extraction des fumées. Pour préserver l’activité lysate, effectuez l’étape rapidement.
Placer 200 aliquots de microlitres de supernatant dans des flacons pré-refroidis et les casser immédiatement les congeler avec de l’azote liquide. Conservez les flacons à 80 degrés Celsius négatifs pour une utilisation future. Dissoudre séparément le POPC et le cholestérol dans le chloroforme chacun à une concentration finale de 100 milligrammes par millilitre.
Vortex chaque flacon séparément. Dans un flacon de verre de deux millilitres, mélanger les composants. Ajouter 50 microlitres de la solution cholestérol-chloroforme, 50 microlitres de la solution POPC-chloroforme et 500 microlitres d’huile minérale.
Vortex le flacon, puis pour évaporer le chloroforme, le chauffer pendant environ une heure à 80 degrés Celsius dans une hotte chimique. Avant de commencer l’étape de production des cellules synthétiques, préparez les solutions extérieures, pré-intérieures et d’alimentation décrites dans le manuscrit. Placez ensuite 1,2 millilitres de la solution extérieure dans un tube de 15 millilitres et ajoutez lentement une couche de 500 microlitres de solution lipidiques dans l’huile à partir du premier flacon de verre.
Incuber le tube à température ambiante pendant 20 minutes. Pour finaliser la préparation de la solution interne, mélanger sur la glace à un volume final de 100 microlitres en ajoutant du lysate S30-T7 et du plasmide d’ADN. Ajouter 100 microlitres de la solution intérieure avec du lysate et du plasmide au deuxième flacon de verre de deux millilitres avec 500 microlitres de solution lipidiques dans l’huile.
Pipette de haut en bas vigoureusement pendant une minute, puis vortex pour une autre minute au niveau cinq. Après avoir incubé l’émulsion qui en résulte pendant 10 minutes sur de la glace concassée, ajouter lentement l’émulsion au-dessus de la phase d’huile dans le tube de 15 millilitres. Centrifuger le tube pendant 10 minutes à 100 fois g et quatre degrés Celsius.
Puis centrifugeuse pendant 10 minutes à 400 fois g et quatre degrés Celsius. À la fin de la centrifugation, une pastille doit être observable au fond du tube. Pour extraire la pastille, retirez d’abord l’excès de couche d’huile.
Ensuite, chargez une pointe de pipette parée avec environ 400 microlitres de solution extérieure et utilisez la pointe pipette pour recueillir la pastille, libérant la solution extérieure pendant que la pointe pipette traverse la phase d’huile. Essuyez la pointe pipette et transférez la pastille dans un tube propre de 1,5 millilitre. Centrifugeuse la pastille pendant 10 minutes à 1000 fois g et quatre degrés Celsius.
Retirez le supernatant et réutilisez la pastille dans 100 microlitres de solution d’alimentation. Pour l’expression des protéines, incuber la suspension pendant deux heures à 37 degrés Celsius sans trembler. Les plasmides exprimant le modèle de protéine sfGFP et Renilla luciferase ont été introduits dans la synthèse des protéines sans cellules, les réactions en vrac cfps, et les cellules synthétiques.
La production de protéines a été évaluée à l’aide de plusieurs méthodes. L’analyse occidentale de tache a détecté la production his6 de sfGFP dans les réactions en vrac de CFPS et à l’intérieur des cellules synthétiques. Purifié sfGFP His6 a été utilisé comme un contrôle positif.
Un microscope fluorescent avec un Brightfield et un filtre GFP montrent des cellules synthétiques qui produisent sfGFP. La cytométrie d’écoulement a été employée pour analyser sfGFP produisant des cellules synthétiques. Le calcul de la population active de cellules synthétiques était basé sur le seuil d’intensité de fluorescence sfGFP défini par l’échantillon négatif d’ADN représenté par l’histogramme rouge.
L’intensité moyenne de fluorescence des cellules synthétiques productrices de sfGFP a été calculée à partir de la population active de cellules synthétiques et normalisée à l’échantillon négatif d’ADN. Les distributions de diamètre des cellules synthétiques actives ont été calculées sur la base du signal sfGFP. L’activité de renilla luciferase a été quantifiée avec des mesures de luminescence.
Cette méthode est très polyvalente et peut être optimisée pour différentes protéines cibles en modifiant l’origine du lysate, la composition lipidique et les concentrations de solutions intérieures. L’analyse FACS des cellules synthétiques produisant une protéine marqueur fluorescent pourrait être effectuée pour fournir une valeur quantitative de la fraction des cellules synthétiques actives. L’analyse occidentale des taches mesurerait la production de protéines.
