Le FPOP en cellule couplé à la spectrométrie de masse est une nouvelle technique puissante utilisée pour étudier les interactions protéiques et les changements structurels protéiques dans les cellules vivantes. Avec FPOP dans les cellules, vous n’avez pas besoin d’isoler les protéines d’intérêt, mais pouvez plutôt les étudier dans leur environnement natal. Ceci est particulièrement utile pour les protéines membranaires.
Avec cette méthode, vous pouvez étudier les changements dans la structure et les interactions protéiques dans une variété de maladies, y compris le cancer et les troubles génétiques, afin que vous puissiez mieux les comprendre et les caractériser. Pour commencer l’assemblage du système d’écoulement, utilisez une pierre de clivage pour couper le tube de silice fondu aux tailles appropriées. Ensuite, placez six petits aimants cylindriques dans une seringue de 500 microlitres et remplissez la seringue, une deuxième seringue de 500 microlitres et deux seringues de cinq millilitres avec tampon de gaine.
Après avoir enlevé l’air, placez les seringues sur la pompe à seringues et serrez le bouchon de la pompe à seringues de sorte que la seringue cellulaire a environ 50 microlitres à gauche lorsque le moteur stagne. À l’aide d’un adaptateur de leurre, connectez une valve manuelle à chaque seringue et assemblez le tube de silice tel qu’illustré, en s’assurant d’enfiler la cellule ainsi que la ligne de silice de peroxyde d’hydrogène à travers la croix et de l’insérer directement dans la ligne de silice 450 ID. Lorsque tous les tubes ont été connectés, placez le système d’écoulement à côté d’un laser et utilisez un briquet pour brûler le revêtement en silice sur le tube de diamètre intérieur de 450 micromètres pour faire une fenêtre pour l’irradiation laser.
Placez un agitateur magnétique au-dessus de la seringue cellulaire contenant les six aimants et réglez la pompe à seringues à 492,4 microlitres par minute pour un débit final de 1083,3 microlitres par minute. Flow buffer à travers le système trois fois pour rincer le système, en vérifiant chaque connexion pour toutes les fuites. Utilisez une lentille convexe pour concentrer le laser excimer sur le tube de silice.
Pour tester la fenêtre d’irradiation, placez un petit morceau de papier derrière le tube de silice et allumez le laser. Ensuite, mesurez la région brûlée par l’irradiation et utilisez la fenêtre d’irradiation et le débit pour calculer la fréquence laser nécessaire pour obtenir une fraction d’exclusion de zéro. Pour recueillir les cellules pour la procédure, lavez les cellules d’une culture de flacon T175 confluente de 70 à 90% avec une solution appropriée de sel de qualité de culture cellulaire.
Resuspendez les cellules en 10 millilitres de tampon pour compter et recueillir les cellules par centrifugation. Il est essentiel de compter les cellules pour s’assurer qu’elles sont suffisantes pour l’analyse en aval, mais pas trop pour les amener à s’agréger et obstruer le système d’écoulement. Puis résuspendez les cellules à deux fois 10 à la sixième cellule par millilitre de concentration tampon de gaine et aliquot les cellules dans un volume de 500 microlitres par échantillon.
Pour le FPOP en cellule, remplissez les deux seringues de cinq millilitres avec tampon de gaine fraîche, la seringue de 500 microlitres contenant les aimants avec un aliquot de cellules, et la seringue finale de 500 microlitres avec du peroxyde d’hydrogène fraîchement préparé de 200 millimlaires. Allumez l’agitateur magnétique et piquez dans 220 microlitres de sulfure de diméthyle à un aliquot de Quench. Après un mélange doux, placez le Quench derrière le système d’écoulement pour recueillir les échantillons irradiés et allumer le laser.
Après sept secondes, allumez le système d’écoulement. Une fois que l’échantillon finit de couler, éteignez le laser et mélangez doucement le Quench avec l’échantillon recueilli. Ensuite, remplissez les quatre seringues avec un tampon frais et rincez le tampon à travers le système d’écoulement.
Une fois que le système a terminé le rinçage, répétez la procédure avec un nouvel aliquot de cellules et de solutions sans irradiation comme le contrôle sans laser pour tenir compte de l’oxydation de fond dans les cellules. Pendant que l’échantillon suivant est en cours d’exécution, centrifugez le premier échantillon et réutilisez la pastille dans 100 microlitres d’un tampon de lyse cellulaire approprié. Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse pour obtenir une congélation éclair dans de l’azote liquide.
Lorsque tous les échantillons ont fini de fonctionner, démonter le système d’écoulement et jeter le tube de silice utilisé. Ensuite, nettoyez toutes les autres connexions par sonication pendant une heure dans une solution 50% eau 50% méthanol. Après avoir isolé et digéré les protéines du lysate cellulaire selon les protocoles standard, analyser le lysate cellulaire digéré selon les protocoles lcms tandem standard pour localiser la modification FPOP protium-large.
Ensuite, chargez les données dans un logiciel approprié d’analyse des protéines et analysez les données à partir d’une base de données de protéines pertinente et de l’enzyme digeste pertinente. Une fois les fichiers terminés, calculer l’étendue de l’oxydation FPOP sur la protéine d’intérêt. L’imagerie par fluorescence des images empilées d’YZ orthogonal montre une séparation claire du tampon de gaine de la solution cellulaire pendant qu’elle coule au-delà de la fenêtre d’irradiation de laser.
Des cartes thermiques moyennes tridimensionnelles du tampon de gaine ou de la solution cellulaire peuvent être générées pour illustrer le mélange minimal des deux solutions. L’utilisation du système de flux cellulaire unique augmente le nombre de protéines oxydativement modifiées de 13 fois. Pour confirmer la modification des protéines d’intérêt dans les cellules intactes, l’imagerie par fluorescence peut être effectuée après le traitement au peroxyde d’hydrogène et l’irradiation.
En utilisant la spectrométrie de masse tandem, ces modifications peuvent être localisées à des acides aminés spécifiques sur une protéine. Le décalage observé dans ce chromatogramme d’ion extrait se traduit par le changement d’hydrophobicité provoqué par la méthionine oxydée dans le peptide modifié. La comparaison de l’actine étiquetée dans les cellules par empreinte in vitro révèle des niveaux similaires d’oxydation, ce qui indique que l’actine a une accessibilité similaire aux solvants pour les études incellales et in vitro.
En outre, la comparaison de l’étendue de l’oxydation photochimique rapide de la protéine d’intérêt modifie l’accessibilité des solvants, les résidus étiquetés calculés à partir de deux structures cristallines d’actine démontre que l’oxydation photochimique rapide en cellule de la protéine d’intérêt sonde efficacement l’accessibilité des solvants de la protéine monmérique. Il y a plusieurs étapes supplémentaires que l’on peut prendre pour augmenter la détection des modifications fpop abondantes inférieures, y compris la chromatographie 2D, la fractionnement subcellulaire, et les techniques de multiplexage protéomique. Avec l’utilisation de FPOP dans les cellules, nous pouvons maintenant effectuer la biologie protéomyostructurale pour mieux connecter les structures protéiques avec la fonction cellulaire.
En raison de la longueur d’onde de 248 nanomètres requise pour fpop, assurez-vous de toujours porter des lunettes de protection UV et des vêtements appropriés pour éviter l’exposition involontaire aux rayonnements réfléchis ou dispersés.
