L’empreinte des protéines de radical hydroxyle sans laser facilite grandement l’identification des sites d’interaction des protéines et des régions de changement de confirmation, accélérant la recherche dans les études d’agrégation, de structure et de stabilité des protéines. Avec la dosimétrie radicale en ligne, les utilisateurs peuvent ajuster la charge efficace de radicaux hydroxyles en temps réel, et avec la dosimétrie radicale en temps réel, vous pouvez économiser du temps expérimental et un échantillon précieux tout en améliorant la reproductibilité de l’étiquetage. Pour commencer, cliver un capillaire de silice de 250 micromètres de diamètre intérieur à 27 pouces avec une pierre de clivage de silice, en vérifiant les extrémités du capillaire pour une coupe propre et droite.
Créez deux fenêtres d’environ 15 millimètres de longueur. À partir de l’extrémité inférieure du capillaire, brûlez le revêtement en polyimide de 90 millimètres pour créer la fenêtre de photolyse et de 225 millimètres pour la fenêtre du dosimètre. Insérez l’extrémité inférieure du capillaire juste au-delà de l’extrémité conique d’un écrou et d’une virole.
Ajouter le capillaire à l’orifice cinq, serrant juste au-delà du doigt serré avec une clé. Retirez le capuchon de la cellule de photolyse du module de photolyse en le tirant directement, puis retirez le masque métallique monté magnétiquement, qui maintiendra le capillaire en place. Ouvrez la cellule du dosimètre en appuyant sur la languette à gauche et balancez la cellule du dosimètre ouverte vers la droite.
Retirez les clips montés magnétiquement qui maintiendront le capillaire en place. Placez ensuite le capillaire dans le canal rainuré à la base de la cellule de photolyse, et centrez la fenêtre capillaire avec la fenêtre de la cellule de photolyse. Maintenez le capillaire en position et ajoutez le masque magnétique.
Replacez le bouchon de photolyse en position. Placez le capillaire dans le canal rainuré à la base de la cellule du dosimètre et centrez la deuxième fenêtre capillaire sur la petite ouverture au centre de la cellule du dosimètre. Tout en maintenant le capillaire en position d’une main, placez les deux clips magnétiques en position pour maintenir le capillaire en place.
Fermez la cellule du dosimètre jusqu’à ce qu’elle clique sur fermé. Enfin, insérez le capillaire à travers le bouton moleté au-dessus de l’ascenseur capillaire du collecteur de produit, en étendant le capillaire juste au-dessus du fond du flacon. Coupez la longueur souhaitée du tube en téflon à l’aide d’une fraise et vérifiez les extrémités pour une coupe droite propre.
Insérez une extrémité de la nouvelle boucle d’injection à travers l’un des écrous et placez une nouvelle virole sur l’extrémité du tube. Maintenez l’écrou et la virole en place tout en insérant le tube dans l’orifice six de la vanne d’injection jusqu’à ce qu’il soit au fond. Serrez l’écrou avec une clé, puis confirmez que l’écrou et la virole sont solidement en place.
Une fois que les deux extrémités ont un écrou et une virole fixe, vissez lâchement une extrémité à l’orifice trois et l’autre extrémité à l’orifice six. Une fois en position, serrez les deux côtés pour serrer le doigt, puis un quart de tour au-delà du doigt serré avec une clé. Allumez le système HRPF sans laser en démarrant le module fluidique, suivi du module de photolyse, du module de dosimètre, du collecteur de produit et de l’ordinateur système.
Lancez le logiciel système. Submergez complètement le tube dans 10 millilitres de tampon à partir de la position de la vanne sur la pompe à seringue. Dirigez le tube de la position des déchets et le tube du port deux sur le port de seringue vers un récipient vide pour collecter les déchets.
Placer des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre à la position marquée HN6 sur le carrousel collecteur du produit. Rincez la boucle d’injection cinq fois en injectant 25 microlitres d’eau de qualité HPLC avec la vanne réglée sur la position de charge. Tournez manuellement la vanne d’injection pour rincer le reste du système.
Sélectionnez Traiter sur le logiciel de contrôle pour commencer à couler de l’eau jusqu’à ce qu’une gouttelette se forme. Faire une solution contenant deux adénine millimolaire et 10 protéines micromolaires. Ensuite, faites une solution de trempe en utilisant 0,3 milligrammes par millilitre catalase et 35 millimolaires d’amide de méthianine.
Aliquote 25 microlitres de solution de trempe dans un microtube de 200 microlitres. Diluer le peroxyde d’hydrogène à 200 millimolaires, en le maintenant sur la glace. Démarrez la tension de flash à zéro volt sur le logiciel de contrôle.
Ce contrôle zéro volt déterminera toute oxydation de fond sur la protéine d’intérêt. Sélectionnez Démarrer les données AutoZero, puis Traiter puis Prêt. Enfin, tournez la vanne d’injection jusqu’à la position de charge.
Placez la solution de trempe en position un sur le carrousel collecteur de produit, puis changez le flacon de produit en un sur le logiciel de contrôle du système. Immédiatement avant l’injection, mélanger 12,5 microlitres du mélange d’adénine et de protéines avec 12,5 microlitres de peroxyde d’hydrogène. Pipetter le mélange de haut en bas pour mélanger, puis le faire tourner rapidement vers le bas.
Injecter 25 microlitres de cette solution en utilisant le port d’injection dans les 10 secondes suivant le mélange. Passez la vanne d’injection à la position d’injection et attendez pendant le traitement de l’échantillon. Montez la tension de flash à 750 volts sur le logiciel de contrôle et répétez les étapes d’étiquetage.
Notez ensuite l’absorbance de chaque échantillon. Tout d’abord, cliquez sur Sélectionner, puis sélectionnez manuellement le début et la fin de l’absorbance maximale. Dans l’espace disponible, écrivez une description de l’exemple.
Répétez cette opération pour toutes les données acquises. Copiez et collez les données dans une feuille de calcul pour calculer la variation moyenne de l’absorbance de l’adénine pour chaque tension. Une fois que tous les échantillons ont été prélevés, rincer l’orifice de la seringue et la boucle de l’échantillon en fixant la valve d’injection à la position de charge et injecter cinq fois 25 microlitres d’eau HPLC.
Tournez la vanne d’injection jusqu’à la position d’injection pour rincer le reste du système avec de l’eau HPLC. Une fois rincé, arrêtez le flux, quittez le logiciel de contrôle du système et éteignez les modules, en commençant par le collecteur de produits, le module de dosimètre, le module de photolyse et enfin le module fluidique. Lors de l’oxydation, l’adénine utilisée pour la dosimétrie diminue l’absorbance UV à 265 nanomètres.
Le tampon 2 contient un extracteur radicalaire, ce qui diminue le changement d’absorbance de l’adénine par rapport au tampon 1. Apomyoglobin a été modifiée en présence du peroxyde d’hydrogène et de l’adénine à quatre tensions croissantes de lampe de plasma. Six peptides ont été détectés, avec une augmentation linéaire de l’oxydation par rapport au changement de l’absorbance de l’adénine à 265 nanomètres.
Ces six peptides oxydés sont marqués sur une structure cristalline de myoglobine. L’étendue de l’oxydation détectée à partir de la lampe à plasma haute pression est beaucoup plus élevée que la méthode laser. Cette augmentation provient du spectre d’émission UV à large spectre de la lampe à plasma haute pression.
En produisant un large spectre UV, la lampe à plasma haute pression chevauche mieux le domaine d’absorbance du peroxyde d’hydrogène, ce qui entraîne une production plus efficace de radicaux hydroxyles grâce à la photolyse du peroxyde d’hydrogène, par rapport au laser Kr F Excimer et au laser Nd YAG. La lampe à plasma haute pression augmente considérablement la production de radicaux hydroxyles au-delà de ce qui est généralement observé à l’aide d’un laser Excimer Kr F. L’utilisation de peroxyde 100 millimolaires peut provoquer des niveaux élevés d’oxydation de fond.
Si le système protéique est sensible à l’oxydation induite par le peroxyde, diminuer la concentration jusqu’à 10 millimolaires. L’étiquette irréversible de HRPF permet la manipulation des échantillons en aval, y compris les longues digestions de protéase, vous pouvez ajouter une étiquette de masse en tandem pour le multiplexage et effectuer une chromatographie 2D, améliorant ainsi la détection des peptides et la coordination des informations structurelles.
