The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Déclaration éthique: Les procédures expérimentales décrites dans le présent protocole impliquent travaillent exclusivement avec Drosophila melanogaster et ne sont pas soumis aux lois de protection des animaux en Allemagne. 1 Préparation des médias, outils et mouches <ol><li> Préparer le milieu de croissance modifié disponible dans le commerce en poudre M3 sans bicarbonate de potassium 17. ATTENTION: Irritant pour les yeux et la peau. Compléter le milieu avec du sérum de veau fœtal à 10%, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. Utilisez sérum de veau foetal inactivé par la chaleur et les insectes-culture-testé pour de meilleurs résultats. Filtrer le milieu complet (ci-après dénommés moyenne) à travers une unité bouteille-haut filtre de 0,2 um et stocker à -20 ° C. Avant utilisation, le filtre (0,2 um bout filtre de la seringue), le milieu nouveau pour enlever précipités. </li><li> Préparer des solutions inhibiteur d&#39;achat d&#39;actions pour les essais pharmacologiques. Dissolve les produits chimiques dans le solvant et magasin approprié en aliquotes. Par exemple, préparer une solution mère d&#39;acide anacardique mM 28.69 (ATTENTION: Irritant pour les yeux et la peau) dans le diméthylsulfoxyde. </li><li> Préparer les outils de la perturbation des testicules pupes disséqués et dissection de kystes simples. Utilisez deux aiguilles pointues et rigides, plutôt que d&#39;une paire de pinces. La force capillaire qui se développe entre les deux bras d&#39;une paire de pinces permet la dissection de kystes simples dans de petites quantités de milieu très difficile. Par exemple, utiliser la pointe d&#39;une épingle de l&#39;insecte en acier inoxydable inséré dans un support de boucle d&#39;inoculation. </li><li> Afin d&#39;obtenir des pupes appropriée ans, graine environ 10 grands flacons de culture (tubes avec 4 cm de diamètre) avec un nombre suffisant de mouches adultes (environ 40-60 mouches). Pour analyser le commutateur HP, utilisez les mouches exprimant H2AvD-DP et ProtamineB-eGFP dans leur modèle endogène 12,16,22. Incuber les flacons dans des conditions normales à 25; ° C pendant environ 4-5 jours jusqu&#39;à ce troisième stade larvaire crawl et commencer la nymphose sur les parois des flacons 25. </li></ol> 2 Marquage ou collecte blanc pré-nymphes pour obtenir 24 h âgé de pupes pour dissection <ol><li> Pour tester l&#39;influence de certains produits chimiques sur le commutateur HP, disséquer les testicules de nymphe à environ 24 h 12 APF. Pour obtenir pupes mise en scène, de prendre les flacons de culture préparés à la mouche avec pupifier larves (voir section 1.4) et d&#39;identifier le plus grand nombre de pré-pupes blanc que possible. Pré-nymphes au cours de la toute première étape de la nymphose semble immobile, non-alimentation, les larves plutôt raccourci avec stigmates éversées et pupe de couleur blanche. La pupe devient beige brun dans 30 à 60 min, ce qui indique la prochaine étape de développement de pupe 26. </li><li> Marquer les positions de la pré-pupes avec un marqueur permanent à l&#39;extérieur des flacons. Incuber les tubes à 25 ° C pendant environ 24 heures. <ol><li> Alternativement,choisir le pré-pupes du côté des flacons avec un petit pinceau humidifié avec du tampon PBS. Puis transférer le pré-nymphes sur le côté d&#39;un nouveau tube de 50 ml de réaction et incuber à 25 ° C pendant environ 24 heures. </li></ol></li></ol> 3. Dissection de la nymphe testicules à environ 24 heures après la formation Puparium <ol><li> Distribuer quelques gouttes (environ 80 pi) de chaque support 10 cm sur une culture cellulaire en plastique ou une boîte de Petri. L&#39;utilisation d&#39;un large paire de pinces ou un pinceau humidifié avec le milieu, ramasser les nymphes au stade de l&#39;APF de 24 heures à partir des flacons incubés (voir section 2). Transférer un nymphe à chaque goutte de milieu sur le plat. </li><li> Pour la dissection, en utilisant un stéréomicroscope équipé d&#39;un illuminateur à fibre optique. Ne pas chauffer les testicules dessus RT lors de la dissection, cela pourrait empêcher le bon développement de la culture. <ol><li> Disséquer les nymphes avec deux paires de n ° 5 forceps. Avec une paire, prenez la nymphe à sa plus postérieurepartie (les stigmates postérieurs) et maintenez-le en position. </li><li> Prenez les stigmates antérieurs avec l&#39;autre paire de pinces et d&#39;ouvrir l&#39;opercule de chrysalide à son extrémité antérieure. Décoller la coque de nymphose jusqu&#39;à au moins une partie du thorax est exposé. </li><li> Maintenez la chrysalide en position par son extrémité la plus postérieure. Pour relâcher la pression interne de la nymphe, insérer les deux bras d&#39;une paire de pinces dans la région de la tête de la nymphe. </li><li> Rip la nymphe ouverte en ouvrant la pince et le déplacement de la pince dans la direction antérieure. S&#39;assurer que l&#39;ouverture produite par ce mouvement est aussi grande que possible dans la première tentative. Éviter d&#39;endommager la nymphe à son extrémité postérieure avant que la pression a été libérée, car cela pourrait entraîner dans les testicules poussés directement par la petite ouverture et le plus souvent perturbées. </li><li> Remarquez que lorsque la nymphe est ouvert, la pression interne publié de la nymphe appuie sur des agglomérats de cellules de graisse corporelle et de tissus à travers le large ouverture dans la région de la tête. Vérifiez si les testicules des pupes ont déjà été poussé hors de la nymphe avec ce matériel; cela se produit dans certains cas. Les testicules ne sont pas connectés à tout autre tissu à 24 h APF et donc pourraient être expulsés facilement de la pupe 23. </li><li> Éviter de serrer la nymphe avec la pince, car cela pourrait endommager les testicules si elles restent dans la pupe. Augmenter la taille de l&#39;ouverture à l&#39;aide d&#39;une paire de pinces. </li><li> Ensuite, maintenez la nymphe à son extrémité la plus postérieure. Fermez l&#39;autre paire de pinces et doucement série sur le contenu de la chrysalide d&#39;arrière en avant pour libérer les testicules de la pupe. </li></ol></li><li> Recueillir les testicules en les tirant dans une pipette 200 ul prédécoupé. Essayer de transférer seulement une très petite quantité de fluide pour réduire le nombre de cellules du corps gras transférées avec les testicules. Placez les testicules en moyenne dans une boîte de culture frais. Laver les testicules plusieurs fois avec du milieu jusqu&#39;à ce que la cellule de corps peu de graisses restent. </li><li> Pour l&#39;imagerie en direct, transférer les testicules à une boîte de culture à fond de verre avec le milieu et utiliser une imagerie microscope inversé. Pour les essais pharmacologiques, passez à l&#39;étape 5. </li></ol> 4. Dissection de kystes sur la lignée germinale mâle et d&#39;imagerie en direct <ol><li> Transférer un ou plusieurs testicule des pupes à une boîte de culture à fond de verre. </li><li> Utilisez un stéréo-microscope avec fibre optique éclairage et deux aiguilles en acier inoxydable (voir section 1.3) pour la dissection de kystes mâles de la lignée germinale. <ol><li> Avec une aiguille, essayez avec soin pour cerner un testicule à sa antérieure ou postérieure fin. Le maintenir en position. Insérez l&#39;autre aiguille dans le testicule et perturber la gaine du testicule en déplaçant l&#39;aiguille sur le côté. Beaucoup de kystes seront libérés à partir du testicule par ce mouvement. </li><li> Continuez à maintenir le testicule en position avec une aiguille. Série délicatement les kystes restants du testicule avec l&#39;autre aiguille. </li><li> Kystes agrégés séparés soit par gentment le déplacement d&#39;une aiguille latéralement à travers la grappe de kystes ou en transférant les kystes à une boîte de culture frais avec le milieu à l&#39;aide d&#39;une pipette de 200 pi. </li></ol></li><li> Déplacer la boîte de culture à un microscope inversé d&#39;imagerie pour l&#39;imagerie en direct de kystes simples. Disperser kystes à nouveau avec une aiguille si nécessaire. <ol><li> Identifier la phase des kystes à l&#39;aide de contraste de phase et par microscopie de fluorescence. </li><li> Focus sur un kyste de la scène souhaitée. Confirmez accent et la position du kyste fréquemment pendant plus des expériences d&#39;imagerie, comme les kystes ne se conforment pas au fond de la boîte de culture et ont donc tendance à flotter hors de discussion. REMARQUE: revêtement du plat avec de la poly-L-lysine pour l&#39;immobilisation est préjudiciable au développement des premiers kystes de la lignée germinale. Au lieu de cela, les kystes individuels peuvent être isolés. Avec un peu de pratique, il est possible de distinguer un kyste particulier en poussant très doucement avec l&#39;aiguille. Cela permettra le transfert des kystes simples de culte séparéure plats avec une pipette Pasteur en verre avec une pointe haleine qui s&#39;insère dans le champ de vision du microscope. Les kystes isolés peuvent ensuite être facilement transférés dans des boîtes de culture, même après incubation à long terme. </li></ol></li></ol> 5. pharmacologique analyse avec Intact testicules pupes <ol><li> Remplir chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits de culture de cellules avec 500 ul de milieu pour une expérience de 12 répétitions. Transfert d&#39;une pupe testicule dans chaque puits, à l&#39;aide d&#39;une pipette 200 ul prédécoupé. <ol><li> Vérifier la présence des protamines dans les testicules isolées en utilisant un microscope inversé à fluorescence. Les testicules doivent être exempts de signaux ProtamineB-eGFP, qui indique que le commutateur HP n&#39;a pas eu lieu dans l&#39;une des kystes. Remplacer les testicules qui montrent déjà des kystes ProtamineB-eGFP-positifs. </li><li> Pour les 12 premiers puits, ajouter 500 ul de milieu contenant le composé d&#39;inhibiteur dilué (acide anacardique) pour atteindre la concentration finale souhaitée(150 uM) dans 1 ml de milieu par puits. Utilisez les puits restants comme témoins non traités; ajouter 500 ul de milieu avec la même quantité de solvant utilisée comme avec les composés inhibiteurs. Remarque: Si de nombreux composés différents et des solvants sont utilisés, il peut être plus efficace d&#39;utiliser en tant que seul moyen de contrôle et de tester l&#39;influence de l&#39;augmentation des concentrations de solvant dans des expériences séparées. </li></ol></li><li> Incuber la plaque à 25 ° C pendant 24 heures dans l&#39;obscurité. </li><li> Vérifier à nouveau la présence de protamines dans les testicules incubées comme décrit ci-dessus. Les testicules de contrôle doivent maintenant montrer un ou plusieurs kystes ProtamineB-eGFP-positifs, ce qui indique transition à travers le commutateur HP. </li><li> En utilisant une pipette avec une pointe de 200 pi, transférer les testicules à lames recouvertes de poly-L-lysine, faire des préparatifs de squash et tache avec des anticorps fluorescents appropriés comme décrit par ailleurs 12,27,28. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt concurrentes.

Le protocole présenté décrit deux applications différentes en fonction à la fois de la capacité à disséquer les testicules chez la drosophile et les kystes seule lignée germinale à un stade de développement donné et sur ​​le développement ex vivo de ces cellules et de tissus dans une boîte de culture. Une application est la manipulation pharmacologique des processus vitaux au cours du développement des spermatozoïdes. Surtout, ce qui permet l&#39;accès à la spermatogenèse post-méiotique qui n&#39;est pas facilement acquise en utilisant des analyses fonctionnelles basées sur la génétique de la mouche. L&#39;autre application est l&#39;observation microscopique de la vie et le développement des cellules germinales et les testicules. En particulier, cette application bénéficie de l&#39;aptitude des cellules de Drosophila et des organes en culture pour survivre et se développer à la température ambiante et sous atmosphère normale. Par conséquent, un microscope d&#39;imagerie inversé équipé d&#39;une platine chauffée (chauffage à la température de reproduction standard de 25 ° C) est suffisante pour obtenir des résultats significatifs dans des expériences d&#39;imagerie en temps réel. Plusplus, de nombreuses souches de mouches transgéniques exprimant des protéines de protéines étiquetées fluorescentes pour l&#39;imagerie en direct existent ou peuvent être facilement établis. Pour obtenir les testicules des pupes ou des kystes de la lignée germinale d&#39;un stade de développement spécifique, il est crucial que l&#39;on est familier avec le calendrier de développement de la drosophile. Le moment exact de chaque étape peut varier entre les laboratoires, les conditions de culture, et de voler souches et doit être établie de manière empirique. Comme indiqué plus haut, ce qui est particulièrement important pour les essais pharmacologiques, par exemple, ciblent le commutateur HP. Pour ces expériences, il est conseillé de toujours vérifier spermatides avec un signal ProtamineB-eGFP avant le test inhibiteur réelle parce que le timing peut varier légèrement, même dans une seule population. En suivant le protocole ci-dessus devraient permettre à l&#39;expérimentateur de disséquer les testicules de pupes début comme organes intacts libres de tissu de corps gras ci-joint. Ces testicules et, plus encore, isolés gekystes rm-ligne sont très fragiles. Par conséquent, il est crucial de développer la dextérité manuelle et l&#39;expérience nécessaires pour le traitement et le transfert des testicules et des kystes à l&#39;aide des pinces, aiguilles et les pipettes. Surtout études visant le développement des cellules germinales post-méiotique de la méiose et au début profiteraient de cette situation. Bien qu&#39;il soit relativement facile à disséquer les kystes de spermatides fin ayant une longue flagelles de testicules adultes, il est difficile d&#39;obtenir des stades antérieurs. Dissection ces kystes de testicules de nymphe début suivant ce protocole est beaucoup plus efficace. Gardez à l&#39;esprit que dans une souche de mouche d&#39;habitude, seulement environ 50% des pupes sera mâle. Par conséquent, pour préparer disséquer au moins deux fois plus nombreux que le nombre de nymphes des testicules requises. En variante, il est possible d&#39;identifier mâle larves L3 au moyen d&#39;un stéréo-microscope, comme les testicules peuvent être identifiés organes ronds translucides incorporés dans les tissus latérales du corps en matière grasse de la larve intact 23,34, et pour les recueillir dans des flacons de culture fraîches que boîteêtre utilisées pour enlever pré-pupes pour la mise en scène et des dissections. Il est également possible d&#39;identifier des pré-nymphes mâle 35. Nous avons remarqué que les deux kystes lignée germinale isolés et les testicules des pupes intactes en culture sont sensibles à la lumière, comme cela a été indiqué précédemment 18. Cette sensibilité à la lumière pourrait également contenir certains composés chimiques utilisés dans les essais pharmacologiques. Par conséquent, il est préférable de conserver les boîtes de culture d&#39;un test dans l&#39;obscurité pendant l&#39;incubation. De même, lors de la planification time-lapse expériences d&#39;imagerie avec testicules en développement et, en particulier, les kystes isolés, gardez à l&#39;esprit que le temps d&#39;exposition trop longues et / ou des taux d&#39;échantillonnage trop élevées peuvent inhiber ex vivo développement. Le taux d&#39;échantillonnage appropriée doit être déterminée expérimentalement. L&#39;infection bactérienne et / ou fongique et la sur-croissance dans des boîtes de culture pose un problème grave. Des boîtes de culture infectés par le trop grand nombre de bactéries ne supportent pas ex vivo développement des testicules et de kystes. Par conséquent, le milieu de culture décrit contient de la pénicilline et de la streptomycine (voir étape 1.1), mais lors de l&#39;incubation de longue durée, ces antibiotiques peuvent être dégradées et peuvent réduire leur activité. Cela pourrait être une des raisons pour le peu de temps de survie (max. 72 h) des kystes de culture observés lors de l&#39;utilisation du protocole ci-dessus. Pourtant, ce délai ne peut être prolongé par le remplacement régulier du milieu de culture dans les plats. Nous concluons que d&#39;autres facteurs pourraient influer sur la survie de la culture, tels que le manque de signaux provenant d&#39;autres tissus de l&#39;appareil génital de croissance. D&#39;autre part, le développement post-méiotique est plus rapide chez la drosophile que chez les mammifères. Chez la drosophile, la spermiogenèse prend environ 90 heures, et le commutateur HP a lieu entre 50 et 60 heures après la méiose 9,12. Ainsi, le temps de survie d&#39;habitude de l&#39;ordre de 48 heures obtenue avec ce protocole est bien adapté pour suivre les processus de développement pivots dans SPErmatogenesis, telles que les divisions de la méiose ou le commutateur HP. Bien que la contamination bactérienne ou fongique peut être évité en utilisant des outils propres et des médias, le protocole présenté ne fait pas usage de conditions de travail strictement stériles car les mouches voler et testicules contiennent déjà des bactéries lorsqu&#39;ils sont élevés dans des conditions standard. Néanmoins, certaines applications de cette technique de culture pourraient bénéficier de mouches disséquées ou même élevé dans des conditions aseptiques (pour les protocoles, voir 17,36,37). Dosages pharmacologiques dépendent de l&#39;utilisation de composés chimiques qui agissent comme des inhibiteurs ou des activateurs de divers enzymes. Les composés couramment utilisés dans de telles expériences diffèrent souvent considérablement dans leur spécificité de la cible. Comme un avantage, ce qui offre la possibilité de cibler les classes d&#39;enzymes entières, par exemple, avec de l&#39;acide anacardique inhibant p300 / CBP, PCAF, et les membres de la famille MYST de chapeaux 38. L&#39;inconvénient de ce potentiel pourrait être hors cible ou l &#39;induction des effets cytotoxiquesé par ces composés. Par conséquent, chaque composé utilisé dans un essai avec des testicules ou des kystes de nymphose doit être testé pour sa cytotoxicité spécifique et l&#39;effet de différentes concentrations. En outre, de légères variations dans les conditions de culture, la concentration ou l&#39;activité composé, et les variations de la perméabilité de la cellule pourraient conduire à la variabilité des effets induits. Par conséquent, il est nécessaire de surveiller le succès du traitement dans chaque expérience. Par exemple, lorsque nous avons utilisé l&#39;acide anacardique à 150 uM, nous avons observé une légère variabilité dans la force du phénotype de la condensation de la chromatine et entre parfois dans certains testicules, tandis que l&#39;acétylation de l&#39;histone H4 été constamment diminué. Essais pharmacologiques avec les testicules de drosophile en culture ont été utilisées pour analyser les mécanismes pré-et post-méiotiques de la spermatogenèse 4,12,14,21. Comme il est difficile d&#39;accéder à la spermatogenèse post-méiotique avec des outils génétiques pour cibler des joueurs avec essential fonctions pré-méiotiques et de la méiose, cette approche ex vivo constitue une alternative. Par ailleurs, en principe, la méthode peut être adaptée à pulse-chase expériences pour suivre le développement de cellules germinales traitées au cours du temps. Cependant, nous n&#39;avons pas encore testé cette possibilité. Faisant usage de début testicules pupe est un avantage dans les essais pharmacologiques. Tout d&#39;abord, la gaine externe mince des jeunes testicules pupes (autour de 24 h APF) pourrait permettre une meilleure perméabilité des composés chimiques. Deuxièmement, lorsque l&#39;on étudie le commutateur HP post-méiotique, les testicules des pupes disséqués à 24 h APF de la ligne de mouche protamine-exprimant la GFP permet une lecture directe de savoir si le commutateur HP a été affectée ou non. À ce jour, plusieurs protocoles de culture ex vivo d&#39;organes et de tissus, y compris les testicules et les kystes de la lignée germinale chez la drosophile ont été développés (par exemple, voir 4,14,17,20,39,40). Le milieu de culture et les conditions générales utiliséesdans le protocole présenté ici ont été établies en 1979 17. Le système de culture a ensuite été adapté à l&#39;imagerie in vivo du mécanisme de l&#39;individualisation de la fin des kystes post-méiotiques isolées à partir de testicules adultes 4. Précédemment, nous avons indiqué que ces conditions supportent également la survie et la différenciation de la méiose et de cellules germinales post-méiotiques au début de leur kystes pendant environ 48 h 12. Contrairement à d&#39;autres systèmes de culture 19 le calendrier de développement observé dans ces cultures était d&#39;environ compatible avec le calendrier déterminé à partir d&#39;échantillons fixes (pour plus de détails, voir 12). Signaux de fluorescence H2AvD-DP et de protamine-GFP peut être utilisée pour visualiser la morphologie et la composition de la chromatine nucléaire des cellules germinales en culture. Nous avons constaté que pour une identification claire des stades de développement de la culture, ce qui est avantageux sur d&#39;autres critères, tels que l&#39;enroulement des kystes. Surtout, le protocole présenté n&#39;implique pas plus de mouche postefacteurs RACT ou autres croissance autres que le sérum fœtal bovin. En outre, nous montrons ici que ces conditions soient compatibles avec l&#39;imagerie par microscopie à fluorescence de divisions méiotiques ex vivo dans la culture. Les images peuvent être obtenues avec une résolution raisonnable dans un milieu facile à utiliser qui prend en charge le développement à long terme. Ceci est en contraste aux protocoles permettant à court terme (environ 3 h) des observations dans l&#39;huile Voltalef 41,42. Les procédures décrites ci-dessus pour la culture et le traitement pharmacologique des testicules des pupes et des kystes germe de ligne de célibataires de sexe masculin sont facilement adaptables aux nombreux génétique, épigénétique, biologie cellulaire, ou des questions de développement qui peut être étudié chez la drosophile spermatogenèse. Cela inclut en particulier la recherche en mettant l&#39;accent sur les cellules souches de la lignée germinale. Il a été démontré que le développement de cellules souches peut être suivie par l&#39;imagerie en temps réel des testicules adultes cultivés 20,43. Cependant, le mouvement péristaltique des testicules matures gaineh interfère avec l&#39;acquisition d&#39;image. Par conséquent, soit l&#39;imagerie est effectuée en utilisant les testicules fragmentés 43 ou le nombre d&#39;expériences d&#39;imagerie effectuées doit être augmentée pour tenir compte des ensembles de données perdues 20. Testicules pupes début (24 h de l&#39;APF) ne sont pas encore joints à cellules musculaires. Même légèrement plus âgés (36-45 testicules h de l&#39;APF) semblent montrer quelques mouvements péristaltiques (comparer la figure 3 et vidéo supplémentaire 1). Par conséquent, la culture des jeunes testicules pupes que les organes intacts pourrait servir d&#39;alternative. En outre, une fois maîtrisé, la capacité à disséquer les testicules de nymphe et éventuellement isolées kystes lignée germinale se permettre de nouvelles applications à l&#39;aide des kystes simples comme une source de homogène, bien que petite, la population cellulaire. Par exemple, il est ainsi possible d&#39;effectuer une RT-PCR quantitative à analyser la régulation de la transcription de gènes spécifiques au cours de la spermatogenèse étapes définies, comme cela a déjà été démontré <sup&gt; 15.

Le développement des cellules germinales mâles de nombreuses espèces est un processus séquentiel. Il est caractérisé par une série d&#39;événements cruciaux qui culmine dans la formation des spermatozoïdes morphologiquement et épigénétique hautement spécialisé. Dans Drosophila melanogaster, les cellules souches de germes de ligne à la pointe de la fracture du testicule asymétrique pour donner naissance à une nouvelle cellule souche et la spermatogonies, c&#39;est à dire, la cellule fille qui se consacre à la différenciation (voir la figure 1 pour un aperçu) 1,2 . Le spermatogonium subit quatre séries de divisions mitotiques et, avec le début de la méiose, une phase de croissance impressionnante et l&#39;activité transcriptionnelle appelé le stade de spermatocytes. Les cellules provenant d&#39;une spermatogonie restent reliés les uns aux autres et se développent sous forme de faisceau synchronisée enveloppé par deux cellules somatiques a la structure dénommée un kyste. Après l&#39;achèvement de la méiose, la morphologie des cellules germinales mâles est tout à faitrénovée (représenté schématiquement sur ​​la figure 1). Dans un premier temps, les spermatides ronds allongés pour former la structure hydrodynamique de la tête, et le flagelle se développe. Finalement, les spermatozoïdes sont séparés l&#39;un de l&#39;autre par un mécanisme complexe, lié à l&#39;apoptose appelé individualisation 3-5. Chez de nombreuses espèces, y compris Drosophila melanogaster et espèces de mammifères, les changements morphologiques des cellules germinales sont accompagnés par un réarrangement épigénétique remarquable de l&#39;homme de la chromatine des cellules germinales haploïdes, appelé le commutateur histone-à-protamine (commutateur HP) 6 - 9. Peut-être la quasi-totalité de l&#39;histone canonique et de nombreuses molécules d&#39;histone-variantes sont supprimés à partir de l&#39;ADN et sont remplacées par de petites protéines basiques, les protamines, résultant en la structure de nucleoprotamine très compact spécifique de la chromatine de spermatozoïdes matures. Caractéristiques générales du commutateur HP sont til remplacement des histones canoniques première par des variants d&#39;histones, puis par les protéines de transition, et, enfin, par des protamines. Tout cela est accompagné par plusieurs changements à des marques épigénétiques, comme une augmentation des niveaux de l&#39;histone H4 d&#39;acétylation juste avant le retrait de l&#39;histone 7,10 - 12. La plupart, sinon la totalité, des procédés mentionnés ci-dessus sont essentiels pour le développement du sperme mûr, entièrement fertiles. Cela est vrai non seulement chez la drosophile, mais aussi chez les humains, que les actions de la spermatogenèse mammifères une quantité considérable de similitude avec le 1,8,9 système invertébrés. L&#39;étude du développement des cellules germinales mâles est grandement facilitée dans le système de modèle de Drosophila. Les mouches sont génétiquement très accessible. La génération de mutants, ainsi que la création de souches de mouches exprimant des gènes de fusion ou des constructions d&#39;interférence de l&#39;ARN prend peu d&#39;effort. Cependant, dans l&#39;étude de la spermatogenèse post-méiotique, l&#39;utilisation de mutants d&#39;d outils génétiques simples pourraient atteindre une limite. Chez la drosophile spermatogenèse, la transcription cesse presque complètement à l&#39;entrée dans les divisions de la méiose. Ainsi, la spermatogenèse post-méiotique est basée principalement sur ​​des ARNm translation refoulées et stockées synthétisés dans un la méiose prolongée de 13 à 16. Par conséquent, des outils tels que l&#39;interférence ARN ou l&#39;utilisation de mutants non-conditionnelles ne sont pas adaptés pour étudier spécifiquement les rôles post-méiotiques de produits de gènes qui remplissent également des fonctions essentielles dans le développement des cellules germinales pré-méiose ou de la méiose. Un avantage de la drosophile qui peut être exploitée dans un tel cas, c&#39;est la capacité de testicules intacts disséqués et même des kystes de cellules germinales à développer ex vivo dans un milieu de culture 4,12,17 - 20. La dissection et la culture des testicules ou des kystes lignée germinale permet non seulement l&#39;observation microscopique du développement des cellules germinales dans les cellules vivantes, mais unLSO l&#39;utilisation d&#39;essais pharmacologiques, par exemple, des inhibiteurs de complexes enzymatiques tels que histones acétyltransférases (HAT), les histone désacétylases (HDAC), ou les topoisomérases, le protéasome. Ainsi, il est possible de manipuler les fonctions enzymatiques cours de la spermatogenèse post-méiotique et de suivre les résultats du développement, indépendamment des fonctions embryonnaires, pré-méiotiques, ou la méiose 4,12. Dans des essais pharmacologiques, nous avons analysé précédemment la localisation d&#39;acétylation dépendante d&#39;une protéine de bromodomain pendant la méiose ainsi que la pertinence des niveaux d&#39;histone acétylation pour le commutateur HP épigénétique de la spermatogenèse post-méiotique en utilisant des inhibiteurs spécifiques ciblant les chapeaux et les HDAC 12,21. Cibler le commutateur HP dans ces essais a été rendu possible en utilisant une souche de mouche qui exprime les gènes de fusion histone2AvD-DP et protamineB-eGFP 12,22 dans les modèles endogènes, et l&#39;observation queles premiers spermatides dans les testicules des pupes passent par le commutateur HP entre 24 et 48 h 12 APF. Le protocole présenté décrit la dissection des testicules et des kystes de la drosophile pupes, les conditions de culture, et un test pharmacologique avec les testicules de nymphe intactes. A cet effet, les testicules de nymphe à environ 24 h après la formation du puparium (CSA) sont disséqués (voir les figures 1 et 2). A ce moment, les testicules ont pas fait des connexions à d&#39;autres tissus et sont entourés par une gaine extérieure seulement mince, ce qui permet une meilleure pénétration des composés inhibiteurs 23,24. Les testicules sont les organes de haricot ou en forme de poire qui peuvent être facilement pris en culture. Ces testicules sont disséquées, cultivées et traitées avec des inhibiteurs spécifiques. Par la suite, les effets des inhibiteurs sont surveillés à l&#39;aide d&#39;analyses par immunofluorescence et microscopie de fluorescence de l&#39;expression de la protéine de fusion, et par comparaison de la MORPHOL nucléairegie des cellules germinales traitées à celui des cellules germinales non traités. Les conditions présentés dans ce protocole permettent également imagerie en temps réel de développer des testicules et des kystes de la lignée germinale dans la culture.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Anacardic acid</td>
			<td style="width:105px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:99px;">172050</td>
			<td style="width:247px;">brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-acetyl-Histone H4</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-598</td>
			<td>brand: Upstate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioObserver.Z1 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont 5-Inox forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fiber optical&#160; illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inoculation loop or pin holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5018</td>
			<td rowspan="2" style="width:247px;">In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5014</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plates, 24-wells</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>351147</td>
			<td>brand: Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen Strep</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15070</td>
			<td>brand: Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stemi SV6 binocular</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

Au cours de la spermatogenèse chez les mammifères et chez Drosophila melanogaster, les cellules germinales mâles développent dans une série de processus de développement essentiels. Cela comprend la différenciation d&#39;une population de cellules souches, l&#39;amplification mitotique et la méiose. En outre, les cellules germinales post-méiotiques sont soumis à un procédé de déformation morphologique ainsi que dramatique une reconfiguration globale épigénétique de la chromatine, le commutateur histone-à-protamine lignée germinale. Etudier le rôle d&#39;une protéine dans la spermatogenèse post-méiotique par mutagenèse ou d&#39;autres outils génétiques est souvent entravée par embryonnaire essentiel, pré-méiotique, ou des fonctions de la méiose de la protéine à l&#39;étude. Le phénotype post-méiotique d&#39;un mutant d&#39;une telle protéine peut être masquée par un bloc plus tôt de développement, ou de l&#39;interprétation du phénotype pourrait être compliqué. L&#39;organisme modèle Drosophila melanogaster offre une voie de contournement à ce problème: les testicules intacts etmême kystes de cellules germinales disséqués à partir de nymphes précoce sont capables de développer ex vivo dans du milieu de culture. Faisant usage de ces cultures permet l&#39;imagerie microscopique des cellules germinales dans les testicules vivre et de kystes de la lignée germinale. Fait important, les testicules cultivées et des cellules germinales deviennent également accessibles aux inhibiteurs pharmacologiques, ce qui permet la manipulation des fonctions enzymatiques au cours de la spermatogenèse, y compris les étapes de post-méiotique. Le protocole présenté décrit comment disséquer et de cultiver les testicules des pupes et des kystes de la lignée germinale. Informations sur le développement des testicules des pupes et des conditions de culture sont prévues parallèlement aux données d&#39;imagerie de microscope de testicules en direct et les kystes de la lignée germinale dans la culture. Nous décrivons également un test pharmacologique pour étudier la spermatogenèse post-méiotique, illustrée par un essai ciblant le commutateur histone-à-protamine en utilisant l&#39;acide anacardique inhibiteur d&#39;histone acétyltransférase. En principe, cette méthode de culture peut être adapté pour répondre à de nombreux oquestions de recherche utres de la spermatogenèse avant et après la méiose.

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Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex vivo Culture de la drosophile pupes testicule et seul mâle kystes lignée germinale: Dissection, l&#39;imagerie et le traitement pharmacologique

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.3K vues.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Vidéo: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Recherche

Biologie

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophile larvaire JNM Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mésoscopique fluorescence tomographie pour In vivo L&#39;imagerie du développement Drosophile</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection et la coloration des Drosophile Ovaires larvaires

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Culture ex vivo des cellules humaines primaires épithéliales des trompes de Fallope

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

L&#39;immunohistochimie drosophile Abdomen Nymphe

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagerie à travers le cas de la nymphe<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Culture de la peau de souris embryonnaires et Live-imagerie de la migration mélanoblaste

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo L&#39;électroporation et microinjection de testicule de souris

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Souris foetal entier Intestin Système de culture pour<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulation des voies de signalisation et d&#39;imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités