En utilisant ce protocole, n’importe quel laboratoire qui a un microscope confocal standard équipé d’un laser de 405 nanomètres peut effectuer des ablations laser progénitrices de cellules capillaire et surveiller leur régénération. Contrairement à l’électro-ablation, cette technique limite les dommages aux cellules environnantes et est plus accessible qu’une puissante configuration laser UV pulsée. L’imagerie confocale peut également être effectuée immédiatement avant et après l’ablation.
Cette technique nous permet de mieux comprendre le comportement régénérateur des progéniteurs sensoriels, ce qui peut aider au développement de thérapies pour la perte auditive humaine. Pour le montage, la première pipette trois à quatre anesthésier les larves dans une petite gouttelette de solution de tricaine E3 au centre du plat de 35 millimètres, avec un numéro de 14 millimètres 1,5 couvercle glisser en bas. Enlever la solution excédentaire de sorte que les larves restent dans une petite gouttelette juste assez grande pour les contenir.
Et placez le plat sur la scène d’un microscope stéréo binoculaire. Manipulez le zoom et concentrez-vous de façon à ce que toutes les larves soient dans le champ de vision et utilisez une pipette de transfert pour ajouter une fine couche d’agro-solution sur le glissement de couverture. Retirer l’excès d’agros jusqu’à ce que le liquide remplisse le puits au fond du plat, en prenant soin de ne pas aspirer les larves.
Et utilisez un couteau à cheveux pour orienter rapidement les larves dans l’agro-solution avec le côté rostral face à gauche. Appuyez doucement les larves vers le bas contre le verre, de sorte que les larves se trouvent dans le profil avec leurs côtés droits face vers le bas. Après environ 60 secondes, les agros commenceront à se solidifier et les larves ne pourront pas être réorientées.
Après cinq minutes, utiliser une pipette de transfert pour remplir le plat à mi-chemin avec E3 complété par 1X tricaine. Pour localiser les cibles potentielles, allumez la puissance du système de microscopie confocale à balayage laser et initialisez le laser à l’aide du logiciel d’imagerie intégré. Sélectionnez l’objectif d’immersion d’huile 63X Plan-Apochromat et appliquez de l’huile d’immersion sur la lentille.
Fixez le plat dans un insert circulaire avec l’aspect rostral des larves orientées vers la gauche. À l’aide d’un champ lumineux ou d’un éclairage différentiel de contraste d’interférence, sélectionnez l’une des larves montées pour l’imagerie et utilisez le bouton de mise au point pour mettre la peau sur le côté du poisson le plus proche de la couverture se mettre au point. Passez à l’éclairage épifluorescent dans le canal GFP et localisez la ligne latérale postérieure par expression GFP le long du myoseptum horizontal.
Les anneaux des cellules fluorescentes sont indicatifs des cellules neuromast de manteau et les brins allongés des cellules sont les cellules interuromast. En commençant par le premier neuromast de primordium migrateur, utilisez le joystick de contrôle de scène pour scanner visuellement caudally le long du myoseptum horizontal. Après la chaîne des cellules interuromast jusqu’à ce que la région entre le troisième et le quatrième neuromasts migrateurs de primordium soit atteinte.
Si plusieurs larves doivent être photographiées, sélectionnez la position pour définir la position du premier étage. Une fois que les corps cellulaires de la région L3, L4 ont été identifiés, passez au mode d’acquisition et utilisez un laser approprié pour activer la piste d’imagerie GFP. Pour ajouter un canal lumineux transmis à la piste laser activée, cliquez sur la boîte T-PMT dans le menu de dropdown de configuration d’imagerie.
Pour l’image des larves d’ET20, sélectionnez le laser à 488 nanomètres, réglez la puissance laser à 6 %, la taille du sténopé à un équivalent d’unité de zone et le gain numérique à 750. Ajustez les gains de telle sorte que les corps cellulaires soient saturés pour capturer des projections autrement faibles et des filopodes. Et réglez la taille du cadre à 1024 par 1024 pixels, la moyenne à deux et le zoom numérique à 0,7.
Cochez la case pile Z pour faire monter le menu de dropdown de position Z. Tout en scannant rapidement, concentrez-vous jusqu’à ce que les cellules interuromast soient juste hors de discussion et réglent la première tranche. Concentrez-vous à travers l’échantillon jusqu’à ce que les cellules interuromast soient une fois de plus hors de discussion et réglent la dernière tranche.
Cliquez ensuite sur arrêter et cliquez sur démarrer l’expérience pour capturer une pile Z de pré-ablation. Si les positions d’étape ont été ajoutées, inactivez l’option positions de sorte que seule la position actuelle est image et enregistrez le fichier une fois qu’il a été capturé. Pour l’ablation laser des corps cellulaires ciblés, cliquez sur afficher tous les outils dans l’interface d’acquisition et dans le menu d’installation d’imagerie, sélectionnez ajouter une nouvelle piste.
Cliquez sur colorant et sélectionnez DAPI. Sous les canaux, sélectionnez 405 pour le réglage laser et augmenter la puissance laser à 75%Unclick le canal DAPI pour éteindre le laser tout en scannant pour les corps cellulaires candidats pour l’ablation. Cliquez en direct et avec le corps d’une cellule interneuromast centrée dans le champ de vision, zoomez sur le cadre de balayage à 20 à 22X.
Arrêtez la numérisation en direct dès que le corps cellulaire remplit le champ de vision. Vérifiez la boîte d’obturateur laser de 405 nanomètres pour activer la piste et régler une mise à jour pendant 45 secondes. Ensuite, activez la numérisation continue et démarrez la insurrateur.
Arrêt immédiat de la numérisation à 45 secondes. Pour l’imagerie des corps cellulaires post-ablation, sous le menu canaux, déféquez la piste DAPI pour inactiver le laser d’ablation et ouvrir le menu mode d’acquisition. Cliquez sur zoom et diminuez le zoom à 0,7.
Pour évaluer le succès de l’ablation cellulaire, numérisez rapidement le champ de vision. Utiliser les mêmes paramètres que ceux de l’imagerie pré-ablation, capturer et enregistrer une image post-ablation. Inspectez l’image du canal de tube photomultiplier de lumière transmise pour confirmer davantage les dommages cellulaires.
Les cellules endommagées démontreront un aspect granulaire et les noyaux gonfleront fréquemment ou apparaîtront irréguliers dans la forme. Pour évaluer la récupération du corps de la cellule post-ablation, activez à la fois la position de l’étape et les options de temps pour la capture d’image en accéléré et définissez les paramètres de temps au point de temps expérimental approprié et aux intervalles de 15 minutes. Ensuite, commencez l’expérience pour acquérir des images et enregistrer le fichier résultant une fois terminé.
Dans cette expérience représentative, la région de la ligne latérale située entre les troisième et quatrième neuromasts migrateurs de primordium a été identifiée et des images de pré-ablation ont été capturées. Le balayage de poteau-ablation a confirmé qu’aucun corps cellulaire n’est resté dans la région ablated. Laissant un espace entre les projections allongées des cellules interuromast adjacentes.
L’analyse du canal de tube photomultiplier de lumière transmise après ablation, révèle les cellules endommagées et mourantes. Marqué par des noyaux gonflés et de forme irrégulière et un aspect granulaire. Le recrutement de grandes cellules amimoeboid qui sont probablement des macrophages peut également être observé.
Dans cette expérience, l’ablation de plusieurs cellules dans les larves transgéniques doubles a créé des lacunes importantes dans la chaîne des cellules interuromast, mais a eu peu ou pas d’effet sur le nerf de la ligne latérale. Après ablation au laser, la taille des écarts peut être mesurée. Allant de quelques microns jusqu’à 100 microns, selon la largeur que les cellules neuromast individuelles et combien de cellules sont sélectionnées pour l’ablation.
Après ablation, certaines cellules interuromast récupérer dans les premières heures de l’imagerie. Avec la probabilité de fermeture de l’écart négativement corrélateur avec la taille de l’écart. Même dans les cellules interuromast qui sont incapables de récupérer cependant, la formation de longues projections des cellules interuromast voisines, qui peuvent ressembler à l’extension des cônes de croissance neuronale peut être observée.
Il est important d’inspecter minutieusement le canal T-PMT à la recherche de cellules endommagées présentant des noyaux et une granularité de forme irrégulière, et de laisser suffisamment de temps pour que ces indicateurs de la mort cellulaire deviennent visibles. Une analyse plus poussée des données de microscopie time-lapse qui en résultent peut potentiellement révéler de nouveaux comportements cellulaires induits par l’ablation au laser et peut guider le développement d’expériences pour identifier les régulateurs de régénération. Cette technique nous a permis d’étudier les régulateurs moléculaires de la régénération cellulaire interneuromast en fournissant une méthode rapide et rentable pour endommager sélectivement ces cellules.
