Les méthodes améliorées de culture pour des échantillons de tumeur patients-dérivés sont d’une importance critique pendant que le champ s’éloigne de l’utilisation des lignes cellulaires conventionnelles. Ce protocole permet la culture in vitro des cellules tumorales dérivées du patient dans une plate-forme qui est agréable à haut débit et le dépistage à haute teneur, contrairement aux modèles de cancer in vivo. La plate-forme incorporant des PDX nous permet d’évaluer des systèmes plus hétérogènes reflétant les tumeurs indigènes.
Cela peut donner un aperçu des mécanismes médicamentux et permettre un dépistage plus rapide des médicaments. La méthode pourrait être étendue par l’incorporation du stroma, de l’endothélium, et des cellules immunisées. Ces co-cultures pourraient être encore plus représentatives de la population et de l’architecture indigènes de tumeur.
Pratiquez le chargement des plaques microfluidiques avec des lignées cellulaires facilement élargies pour devenir très compétents avant de passer à des cellules plus précieuses comme les PDX. L’alignement pendant la distribution des plaques a un impact considérable sur le succès, et une démonstration visuelle peut facilement transmettre ce concept. Pour commencer, transférez le tissu tumoral à un tube conique stérile pré-pesé de 50 millilitres.
Rincer six fois avec 30 millilitres de PBS stérile pour éliminer le sang et les contaminants. Enlever autant de liquide que possible, et peser le tissu tumoral. Transférez le tissu tumoral dans un plat rond de culture de tissu de 60 millimètres, et utilisez une lame stérile de rasoir ou un scalpel pour le hacher en morceaux d’un millimètre.
Ajouter cinq millilitres de milieu de traitement PDX pour recueillir le lisier tumoral. Ajouter cinq millilitres de solution enzymatique de dissociation pour recueillir le lisier tumoral. Rincer le plat de culture avec un autre cinq millilitres de solution enzymatique de dissociation.
Ajouter ensuite cinq millilitres de support de traitement PDX. Incuber 20 minutes à 37 degrés Celsius avec des secousses douces. À mi-chemin du temps d’incubation, faites tourbillonner doucement le tube.
Après l’incubation, pipette de haut en bas doucement avec une pipette sérologique pour briser les touffes. Placez une passoire cellulaire de 70 microns sur un nouveau tube stérile de 50 millilitres et filtrez les cellules. Puis centrifugeuse à 1200 rpm pendant deux minutes pour pelleter les cellules.
Retirez le supernatant et resuspendez en deux à trois millilitres de milieu de culture PDX. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. Utilisez ce tableau pour estimer le nombre requis de cellules dérivées pdx associées nécessaires pour atteindre la densité cellulaire désirée par puce.
Plaque une à deux fois 10 aux six cellules dans cinq millilitres de milieu de culture PDX par puits d’une plaque de culture tissulaire de six puits. Incuber pendant 48 heures à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, et 95% d’humidité avec des secousses douces à 50 à 55 rpm pour favoriser la formation des grappes. Une fois que les grappes se sont formées, procéder à la centrifugation.
Préparez d’abord 20 millilitres de solution de gradient de densité de 100 % en mélangeant soigneusement 18 millilitres de solution de centrifugation de gradient de densité avec deux millilitres de HBSS stérile de 10X dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Diluer cette solution à 100% avec des solutions stériles de gradient de 1X HBSS pour faire 10 millilitres chacune de 20%30%40% et 55% de gradient de densité. Ajouter trois millilitres de solution de gradient de densité de 55 % au fond d’un tube conique de 15 millilitres.
Tenant le tube à un angle, distribuez lentement trois millilitres de solution de gradient de densité de 40% sur le côté incliné du tube et sur le dessus de la couche de 55%. Répétez avec la solution de gradient de densité de 30%. Puis recueillir le surnatant des cultures de rotation PDX avec une pipette sérologique de cinq millilitres dans un tube, rinçant la surface de la plaque doucement.
Centrifugeuse à 1200 rpm pendant deux minutes pour pelleter les cellules. Retirez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire en trois millilitres de solution de gradient de densité de 20 %. Superposez soigneusement la solution de gradient de densité de 20 % avec des cellules sur le dessus du gradient dans le tube de 15 millilitres.
Capuchon les tubes et la centrifugeuse dans une centrifugeuse rotor swing-bucket 30 minutes à quatre degrés Celsius, 2000 fois G, et zéro pause. Après centrifugation, des fractions sont visibles. Les cultures cellulaires PDX viables se trouvent généralement à l’interface de solution de gradient de densité de 40 à 55 %.
Recueillir de deux à trois millilitres de chaque fraction dans des tubes frais de 15 millilitres. Ajouter trois à quatre volumes de 1X HBSS stérile à chaque fraction, et inverser pour bien mélanger. Centrifugeuse à 1000 fois G pendant trois minutes pour pelleter les cellules.
Retirer le surnatant. Resuspendez la pastille cellulaire en un à deux millilitres de milieu de traitement PDX. Transférer un petit aliquot entre 50 et 100 microlitres dans un tube, et ajouter un volume égal de solution enzymatique de dissociation pour la redissociation.
Évaluer le numéro de cellule dans la suspension cellulaire groupée. Comptez les cellules à l’amiomètre ou au compteur de cellules automatisé. Reconstituer les solutions d’hydrogel acide hyaluronique selon les instructions du fabricant.
À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 50 microlitres de HBSS à tous les puits dans des colonnes de fenêtre d’observation d’une plaque microfluidique à deux voies afin de maintenir l’humidité de la culture et des conditions d’imagerie optimales. Calculez le volume de suspension cellulaire né cessaire pour 50 microlitres d’hydrogel à la densité cellulaire désirée, par exemple, 5000 cellules par microlitre. Pour l’ensemencement d’une plaque microfluidique, aliquot le volume calculé dans chacun des quatre tubes stériles centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Réglez le pH de la solution ha thiol à huit avec 1 hydroxyde de sodium normal immédiatement avant l’utilisation. Effectuez une gelation d’essai en mélangeant 40 microlitres de thiol HA avec 10 microlitres de PEGdA et en surveillant la gelation au fil du temps. Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire aliquots pendant deux minutes à 200 fois G et la température ambiante pour pelleter les cellules.
Retirez soigneusement le supernatant et réutilisez les cellules dans 40 microlitres de thiol HA pour un volume final de 50 microlitres. Ajouter 10 microlitres de PEGdA à un aliquot des cellules du thiol HA. Bien mélanger et attendre une à trois minutes avant d’ensemencer la plaque microfluidique.
Apposer une pointe pour distribuer 1,5 microlitres à une pipette à répétition à canal unique, et charger avec les cellules dans la solution hydrogel HA. N’oubliez pas de garder l’hydrogène aliquot bien mélangé pour assurer une distribution uniforme des cellules. Pour ensemencer la plaque microfluidique, alignez la pointe de la pipette perpendiculairement à la lame tout en plaçant doucement la pointe au centre de l’entrée de gel pour assurer le contact, mais pas de pression lors de la distribution de 1,5 microlitres de solution hydrogel.
Observez l’état de remplissage des canaux microfluidiques en regardant du haut de la plaque, du bas de la plaque ou au microscope. Évaluez le chargement à l’aide de ce chiffre comme guide. Une minute après le chargement, inverser la plaque tout en préparant le prochain aliquot.
Répétez l’ensemencement de la plaque microfluidique pour les trois aliquots restants des cellules dans la solution HA. Une fois toutes les copeaux remplies, incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié 45 minutes jusqu’à ce que la gelation soit terminée. Après cela, en utilisant le manuel fourni, assurez-vous que le rocker de perfusion est installé dans l’incubateur de culture cellulaire avec le réglage de profusion correcte à l’angle de 14 degrés et les intervalles de quatre minutes.
Ajouter 50 microlitres de milieu de culture cellulaire PDX à toutes les entrées moyennes. Appuyez doucement sur la plaque contre une surface pour encourager le liquide à remplir les canaux microfluidiques. Ensuite, retournez la plaque pour vérifier si les canaux sont remplis correctement.
Ajouter 50 microlitres de DMEM/F-12 pour tous les médias. Si des bulles d’air sont piégées dans le canal de perfusion, retirez-les en tapant doucement la plaque contre une surface. À l’aide d’un formulaire de disposition du microscope et de la plaque, enregistrez le succès du remplissage des copeaux.
Exclure les copeaux mal remplis de toute autre utilisation expérimentale. Placez la plaque sur un rocker incliné réglé sur une inclinaison de 14 degrés et un cycle de quatre minutes pour commencer la perfusion. Tous les deux jours, remplacer le milieu de culture PDX, d’abord 50 microlitres dans les entrées, puis 50 microlitres dans les points de vente.
Dans cette étude, un rocker de perfusion programmable a été installé dans un incubateur standard de culture cellulaire en veste d’eau, et des lames microfluidiques à deux voies ont été préparées dans un coffret standard de biosécurité pour le chargement. La viabilité et la morphologie microfluidiques de culture de PDX ont été évaluées dans des conditions non séparées et de densité-gradient centrifugation-séparées. Le premier jour, les cultures qui ont subi la méthode de séparation présentaient dix fois moins de cellules mortes individuelles que les cultures non parées.
Fait important, les grappes séparées se composaient principalement de cellules vivantes. Aucune différence statistiquement significative n’a été identifiée pour la distribution de la taille du cluster. Les cultures ont été maintenues dans la plaque microfluidique pendant sept jours.
Le nombre total de cellules vivantes est demeuré constant, et les grappes ont conservé une viabilité d’environ 80 % au cours de la durée de vie de la culture. Rappelez-vous que chaque ligne PDX est unique, de sorte que la facilité de digestion tumorale, la taille phénotypique et la morphologie des grappes, et l’emplacement de l’amas dans la purification du gradient varie. Les cultures PDX établies à l’aide de cette méthode peuvent être assayées avec des analyses de viabilité basées sur l’image ou le lecteur de plaques, fixées et immunofluorescentes étiquetées, ou dissociées pour recueillir des lysates cellulaires pour d’autres protocoles.
La méthode permettra aux chercheurs de récapituler le microenvironnement tumoral afin d’explorer la biologie ou la réponse médicamenteuse des cellules tumorales. Les utilisateurs doivent compléter la formation standard des sujets humains et la formation sur les pathogènes transmissibles par le sang avant de travailler avec des tissus d’origine humaine. L’équipement de protection individuelle approprié doit être porté.
