Nous remercions S. Fouquet et les installations d’imagerie et de cœur animal de l’Institut de la Vision et de l’Institut des Neurosciences de Montpellier (IRM et RAM) pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par des bourses de la Région Ile-de-France et de la Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer à S.C, et de l’Université Paris-Saclay (Initiatives Doctorales Interdisciplinaires) à L.A., par le financement du Conseil européen de la recherche (ERC-SG 336331, PI J. Valette) à E.H., par l’Agence Nationale de la Recherche dans le cadre de contrats ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (France BioImaging) , par la Fondation pour la Recherche Médicale (Réf. DBI20141231328), par le Conseil européen de la recherche (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) et par le programme ATIP-Avenir (PI K. Loulier).

Toutes les procédures animales décrites ici ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles. Les protocoles animaux ont été approuvés par le Conseil d’éthique de l’expérimentation animale de Charles Darwin (CEEACD/N°5).
1. Préparation de plasmides sans endotoxine pour marqueurs MAGIQUEs dans l’électroporation utero
<ol><li>Transformation bactérienne<ol>
<li>Sur la glace, décongeler les cellules dh5 alpha compétentes stockées à -70 °C.</li>
		<li>Réchauffer les plaques d’agar contenant l’antibiotique approprié (100 μg/mL d’ampicilline ou 50 μg/mL de kanamycine) à 37 °C.</li>
		<li>Ajouter 1 μL de 5 à 50 ng d’ADN plasmide magic markers dans 10 μL de cellules alpha décongelées DH5 et incuber sur la glace pendant 10 min sans mélanger.</li>
		<li>Pour la transformation du choc thermique, placer l’aliquot dans un bain d’eau de 42 °C pendant 45 s, puis placer immédiatement sur la glace et attendre 3-5 min.</li>
		<li>Dans des conditions stériles, ajouter 230 μL de SOC moyen et incuber pendant 1 h à 37 °C.</li>
		<li>Étendre le contenu de l’aliquot sur la plaque d’agar et incuber toute la nuit à 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Culture plasmide<ol>
<li>Le lendemain matin, dans des conditions stériles, ramasser une colonie de la plaque d’agar et la mettre dans un tube de 14 mL contenant 2 mL de LB moyen avec antibiotique approprié. Laissez-le incuber pour la journée à 37 °C dans un incubateur secouant à 300 rpm.</li>
		<li>À la fin de la journée, les graines 300 mL de LB avec antibiotique en utilisant la culture de démarrage de 2 mL de l’étape 1.2.1 et incuber pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur secouant à 300 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de l’ADN plasmide<ol>
<li>Le lendemain matin, procéder à la purification de l’ADN plasmide magic markers (c.-à-d. PB-CAG-Cytbow et Tol2-CAG-Nucbow ainsi que des plasmides entraînés par le CAG exprimant des transposases PB et Tol2 et cre recombinase) à l’aide d’un kit maxiprep sans endotoxine suivant le protocole du fabricant.</li>
		<li>Elute l’ADN dans 200 μL d’eau stérile et estimer sa concentration à l’aide d’un spectrophotomètre avant le stockage à -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation des marqueurs MAGIQUEs dans l’électroporation utero (MM IUE)
<ol><li>Préparation des solutions<ol>
<li>Réchauffer 30 mL de solution saline de 0,9% à 37 °C dans un bain d’eau et le garder au chaud pendant toute la durée de la chirurgie.</li>
		<li>Préparer un mélange plasmide contenant PB-CAG-Cytbow et Tol2-CAG-Nucbow (concentration finale, transposases 0,8 μg/μL chacune), PB et Tol2 (concentration finale, 0,4 μg/μL chacune), CAG-seCre (concentration finale, 0,16 μg/μL) et 0,01 % colorant vert rapide en PBS sans Ca2+ et Mg2+. REMARQUE : Aux fins de la reconstruction anatomique des astrocytes, la construction Tol2-CAG-Nucbow peut être omise. Cependant, ce plasmide est utile pour distinguer les doublets des astrocytes étroitement juxtaposés et lors de l’utilisation des marqueurs MAGIQUEs pour sonder les relations clonales entre les astrocytes14.</li>
		<li>Préparer une solution anesthésique contenant 100 μL de kétamine (100 mg/mL) et 100 μL de xylazine (20 mg/mL) dilués dans 2 mL de solution saline.</li>
		<li>Préparez la solution analgésique en diluant la solution de stock de buprénorphine de 0,3 mg/mL 1:10 dans la solution saline.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation du matériel de chirurgie<ol>
<li>Stériliser les outils chirurgicaux (voir tableau des matériaux)à haute température dans un stérilisateur de perles de verre ou équivalent.</li>
		<li>Déposer une goutte de gel électrode dans un plat de 35 mm.</li>
		<li>Insérez la micropipette dans le support du microinjecteur, cassez la pointe de la micropipette et aspirez à la solution ADN.</li>
		<li>Placez une goutte de 1 μL de solution Vert rapide (0,01%) dans le couvercle d’un plat de 3 cm et, en l’utilisant comme référence, ajuster le diamètre de la pointe de la micropipette en cassant sa pointe avec des forceps fins. Ajustez le paramètre de pression de sorte que des gouttes de taille équivalentes soient produites par le microinjecteur, permettant ainsi la livraison d’environ 1 μL de solution d’ADN par injection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de la souris femelle enceinte<ol>
<li>Peser la souris enceinte RjOrl:SWISS.</li>
		<li>Effectuez une injection intraperitoneal avec 12,5 μL par gramme de poids corporel (BW) de solution anesthésique. Attendez 5 min et vérifiez que la souris dort en pinçant son avant.</li>
		<li>Une fois que l’animal ne réagit pas à pincer, injectez-le sous-cutané avec 1,6 μL/g BW de solution analgésique.</li>
		<li>Ajouter une goutte de gel oculaire sur chaque œil pour éviter le séchage pendant la chirurgie et placer le ventre de l’animal sur le coussin chauffant.</li>
		<li>Rasez doucement son abdomen, nettoyez-le avec un tampon imbibé d’iode et désinfectez la zone rasée avec un tampon d’alcool.</li>
		<li>Disposer un champ d’opération en plaçant des compresses stériles autour de la zone rasée, nettoyée et aseté.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Électroporation in utero (IUE)
<ol><li>Injection intraventriculaire<ol>
<li>Couper une incision verticale de 2 cm le long de la ligne médiane à partir de la partie inférieure de l’abdomen, à travers la peau, puis à travers le muscle sous-jacent. Exposez les cornes utérine en manipulant doucement les sacs embryonnaires et évaluez l’emplacement du col de l’utérus et le nombre de sacs embryonnaires de chaque côté du col de l’utérus.</li>
		<li>Orienter le cerveau de l’embryon E15.5 vers l’électroporation afin de voir le bregma, facilement reconnaissable car son emplacement correspond à la jonction des trois vaisseaux sanguins principaux qui courent le long des fissures cérébrales.</li>
		<li>Imaginez une ligne virtuelle entre le bregma (visible à travers le crâne) et l’œil; introduire la micropipette entre la ligne virtuelle et la fissure longitudinale, puis appuyez sur la pédale de l’injecteur pour fournir 1 μL de solution d’ADN dans le ventricule latéral de l’hémisphère ciblé. REMARQUE : Lorsqu’il est injecté à l’endroit approprié, le ventricule latéral rempli apparaît bleu, indiquant qu’il a été rempli de la solution d’ADN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Électroporation<ol>
<li>Appliquer les électrodes (voir tableau des matériaux),préalablement trempées dans du gel électrode, des deux côtés de l’embryon injecté avec l’anode couvrant l’hémisphère injecté. Appuyez sur la pédale de l’électroporateur pour livrer une série de quatre impulsions de 50 ms de 35 V, chacune séparée par un intervalle de 950 ms.</li>
		<li>Humidifier l’embryon avec une solution saline réchauffée. REMARQUE : Les embryons doivent être conservés humides à l’aide d’une solution saline réchauffée pendant toute l’opération chirurgicale et l’utérus ne doit pas se dessécher.</li>
		<li>Répétez les étapes 3.1.2-3.2.2 pour chaque embryon.</li>
		<li>Une fois que tous les embryons ciblés ont été électroporés, remplacez les cornes utérine dans l’abdomen en les poussant doucement avec des forceps à leur position d’origine. Remplissez la cavité abdominale d’une solution saline réchauffée pour empêcher l’utérus de sécher pendant que les sutures sont faites.</li>
		<li>D’abord fermer le muscle abdominal avec une suture absorbable continue, puis la peau avec plusieurs points individuels (~10) en utilisant la suture 4-0.</li>
		<li>Mettez l’animal dans une cage propre, couché sur le côté sur une serviette en papier propre et tournez l’animal de l’autre côté toutes les 5-10 minutes jusqu’à ce qu’il se réveille et commence à se déplacer de lui-même.</li>
		<li>Évaluer l’état de l’animal le lendemain, surtout si un nid a été fait. REMARQUE : Aucun traitement de postsurgery n’est exigé. En l’absence d’un nid, de tout signe de douleur (p. ex., prostration, fourrure hirsute) et/ou de saignements abondants, l’animal doit être euthanasié sans délai.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Récolte et section des tissus
<ol><li>Collecte de tissus<ol>
<li>Injecter du phénobarbital (100 mg/kg de BW) par voie intrapénitale pour une anesthésie terminale au moment de la récolte désiré. Dans ce cas, les temps de récolte étaient aux jours postnatals (P) P4, P7, et P21.</li>
		<li>Effectuez la perfusion intracardiaque à l’aide d’une solution froide à base de paraformaldéhyde préfabriquée.</li>
		<li>Disséquer le cerveau et le placer toute la nuit à 4 °C dans la solution à base de paraformaldéhyde pour la postfixation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Histologie<ol>
<li>Le lendemain matin rincer le cerveau 3x pendant 10 min avec 1x PBS.</li>
		<li>Intégrer le cerveau dans 3% d’agarose dissous en 1x PBS.</li>
		<li>Couper 80 sections de μm à l’aide d’un microtome à lame vibrante.</li>
		<li>Recueillir les sections dans une plaque de 24 puits précalcé avec 1x PBS.</li>
		<li>Monter des sections dans le milieu de montage (voir Tableau des matériaux)entre la glissade et le coverslip. Gardez les glissières montées à -20 °C pour une conservation optimale des protéines fluorescentes et un stockage à long terme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Imagerie confocale multicanal
<ol><li>Paramètres du microscope<ol>
<li>Configurer la configuration du microscope confocal pour exciter séparément les lignes laser mCerulean/mTurquoise2, EYFP, tdTomato/mCherry en utilisant respectivement 440, 515 et 559 nm.</li>
		<li>Utilisez un objectif 20x 0.8 NA (ou NA plus élevé) et ajustez l’échantillonnage XY et la taille z-step selon les critères nyquist. REMARQUE : Les images acquises avec une résolution plus élevée (p. ex., objectif pétrolier 60x 1.4 NA) et les algorithmes de déconvolution permettront la reconstruction des détails les plus fins des tonnelles d’astrocytes. Cependant, l’expérimentateur doit garder à l’esprit que les meilleurs processus d’astrocyte peuvent ne pas être résolus par l’imagerie optique conventionnelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Acquisition d’images<ol>
<li>Trouvez les astrocytes les plus brillants dans la zone électroporée.</li>
		<li>Étant donné que les cellules étiquetées situées près de la surface peuvent sembler plus brillantes que celles plus profondes de la tranche, ajustez les paramètres d’acquisition sur les cellules de surface pour éviter de saturer les images.</li>
		<li>Ajustez les paramètres d’acquisition séparément pour chacun des trois canaux tout en vous assurant d’éviter la saturation des pixels à l’aide de HiLo LUT, qui affiche zéro valeur en tant que valeurs bleues et maximales de pixels en rouge. REMARQUE : Une image suffisamment équilibrée ne doit afficher que quelques pixels bleus et presque aucun pixels rouges.</li>
		<li>Acquérir des piles Z carrelées de 1 024 x 1 024 pixels à l’aide de l’étape motorisée du microscope, avec un chevauchement de 10 % entre les piles adjacentes pour permettre par la suite la reconstruction en mosaïque de la zone électroporée ou de la zone d’intérêt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Segmentation du volume territorial des Astrocytes
REMARQUE : Ceci est effectué à l’aide d’un logiciel commercial (p. ex., IMARIS).
<ol><li>
Préparation de l’ensemble de données
	<ol>
<li>Recadrer les astrocytes étiquetés dans la reconstruction 3D (250 x 250 pixels) en sélectionnant des cellules entièrement enfermées dans la section tissulaire image. REMARQUE : Il est également possible de travailler directement sur des volumes plus importants si l’ordinateur utilisé peut les manipuler.</li>
		<li>Cliquez sur le bouton Surface Bleue dans la barre d’outils Objet de la vue Surpass pour créer une nouvelle Surface pour chaque astrocyte.</li>
		<li>Pour obtenir un meilleur contraste de visualisation, ajustez d’abord les valeurs minimales et maximales de contraste de couleur en cliquant sur Modifier | Afficher l’option d’ajustement d’affichage et faire glisser les deux poignées. Si nécessaire, modifiez la couleur du canal en cliquant directement sur le nom du canal dans la fenêtre d’ajustement d’affichage afin de sélectionner une nouvelle couleur. REMARQUE : Travaillez de préférence toujours avec le même affichage couleur pour éviter les biais visuels.</li>
		<li>Cliquez sur Modifier | Propriétés d’image pour indiquer manuellement la taille du voxel dans les micromètres. Si la taille voxel n’est pas exacte, les calculs de volume seront incorrects.</li>
		<li>Enregistrez les nouveaux paramètres.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Segmentation de surface
	<ol>
<li>Utilisez l’icône bleue pour introduire une surface. Une icône et une boîte Surface apparaîtront sur la liste Scène. Une boîte volume permet de voir/masquer l’ensemble de données.</li>
		<li>Sélectionnez la ligne de surface et cliquez sur Sauter la création automatique | Modifier manuellement.</li>
		<li>Cliquez sur Contour | Visibilité et cliquez sur Aucun. Ensuite, passez à la vue Sélectionnez et cliquez sur le bouton Dessiner.</li>
		<li>Cliquez sur Mode pour sélectionner le mode dessin.</li>
		<li>Utilisez l’outil de dessin semi-automatique Isoline rapide et efficace. Définissez le contour de la cellule en déplaçant le pointeur de la souris sur elle. Si l’aperçu isoline ne correspond pas au contour des astrocytes, ajustez la position du pointeur de la souris. Pour valider l’aperçu, cliquez à gauche sur la sélection. Pour corriger les erreurs potentielles, utilisez la fenêtre Board pour supprimer le contour actuel du plan Z ou appuyez sur Ctrl + Z.</li>
		<li>Utilisation de slice | Position pour naviguer à travers les plans Z, passer à l’avion suivant en changeant le numéro de plan Z et de commencer un nouveau contour. Commencez préférentiellement à partir du milieu de la cellule, puis déplacez-vous vers les extrémités.</li>
		<li>Lorsque les contours ont été dessinés dans tous les plans Z contenant l’astrocyte, cliquez sur Créer surface. Avant de créer une surface, vérifiez que tous les composants sont connectés. Si ce n’est pas le cas, sélectionnez les plus grands ou connectez-les pertinents avant d’exporter des données en volume.</li>
		<li>Vérifiez les données quantitatives affichées dans le panel de données et les statistiques d’exportation au format de feuille de calcul, ce qui permet d’économiser de la valeur en volume et de l’unité.</li>
		<li>Enregistrez la surface sous un nouveau nom pour y accéder plus tard.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Traçage de l’arborisation des astrocytes
REMARQUE : Cela se fait à l’aide du logiciel en libre accès Vaa3D.
<ol><li>Préparation de l’ensemble de données<ol>
<li>Chargez la pile d’images et recherchez des astrocytes isolés ou des astrocytes voisins affichant des couleurs distinctes. REMARQUE : La résolution de la reconstruction peut être améliorée en augmentant l’objectif NA et l’échantillonnage. En fin de compte, cependant, en raison de la limite de résolution de la microscopie confoccale, les meilleurs processus d’astrocyte ne peuvent pas être tracés avec précision. Il faut prendre soin d’éviter les sursegments au-delà de la résolution des images acquises.</li>
		<li>À l’aide des Fidji, recadrer 250 x 250 pixels d’image s’empile autour de chaque astrocyte.</li>
		<li>Comme le traçage Vaa3D est effectué sur une seule couleur, sélectionnez un canal et désactivez les autres canaux.</li>
		<li>Convertissez l’image en RGB et enregistrez-la .tiff format.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Traçage d’arbor<ol>
<li>Ouvrez l’image RVB en Vaa3D. Aller à l’image | Données | Géométrie puis rééchantillonnement de l’imageet ajuste les valeurs de taille x/y et z voxel. REMARQUE : Lors de la reconstruction des arboriculteurs des astrocytes, il faut prendre soin de ne pas tracer les détails plus finement que la résolution fournie par les images.</li>
		<li>Ouvrez une fenêtre 3D en cliquant sur Visualize | visionneuse 3D pour l’ensemble de l’image. Cliquez à droite sur une image 3D et choisissez 1-clic droit pour définir le marqueur. Pointez avec le curseur le centre de l’astrocyte, puis cliquez à droite pour définir un marqueur. REMARQUE : Cliquez sur Escape pour avoir accès à nouveau à la vue 3D.</li>
		<li>Aller à Advanced | 3D tracing | Vaa3D-Neuron2-auto-traçage.</li>
		<li>Sur la fenêtre nouvellement ouverte, sélectionnez le canal sur lequel appliquer le plug-in.</li>
		<li>Choisissez un seuil d’arrière-plan (souvent entre 30 et 90). Adaptez cette valeur pour chaque astrocyte si nécessaire.</li>
		<li>Décochez Radius à partir de la 2D et gardez l’échantillon auto-vers le bas et l’auto-rééchantillon vérifié.</li>
		<li>Réglez cnn_type à 3, length_thresh à 1, et SR_ratio à 0,1.</li>
		<li>Après avoir cliqué sur ok, assurez-vous que le plug-in génère automatiquement deux fichiers basés sur le nom d’origine. Le suffixe -ini.swc et -coordinateX-coordinateY-coordinateZ-app2.swc sera ajouté. Ajoutez manuellement une étiquette distinctive à ces fichiers de noms afin de ne pas les écraser tout en continuant à exécuter le plug-in.</li>
		<li>Open Object Manager, aller à Neuron | Structure de ligne,sélectionnez l’astrocyte tracé, cliquez sur le mode Affichage,et sélectionnez toujours le mode de ligne.</li>
		<li>Retournez à la fenêtre 3D, où apparaît un squelette de l’astrocyte. REMARQUE : Si la segmentation et le signal ne correspondent pas, répétez les étapes 7.2.3-7.2.10 et ajustez le seuil jusqu’à ce qu’ils le soient. Assurez-vous de saisir à nouveau les autres paramètres lorsqu’ils sont réinitialisés lorsque le plug-in est redémarré.</li>
		<li>Cliquez à droite sur le squelette et sélectionnez le neurone de premier | ligne #1... APP2_Tracing d’accéder aux mesures quantitatives qui apparaîtront sur une nouvelle surface de fenêtre| Annotation de l’objet. REMARQUE : En raison de la résolution limitée de la microscopie légère, les mesures affichées sous les éléments énumérés Nombre de branches et nombre de bifurcations ne fournissent qu’une estimation approximative de la complexité des arboriculteurs astrocytes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Clarke, L. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+astrocytes+in+neural+circuit+development.">Emerging roles of astrocytes in neural circuit development.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).</li><li>Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulators+signal+through+astrocytes+to+alter+neural+circuit+activity+and+behaviour.">Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour.</a> Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders:+Astrocyte-synapse+disease.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis.">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+in+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Marqu&#233;s, J., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Identity+Determines+Astrocyte+Cortical+Heterogeneity.">Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity.</a> Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).</li><li>Mart&#237;n-L&#243;pez, E., Garc&#237;a-Marques, J., N&#250;&#241;ez-Llaves, R., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Astrocytic+Response+to+Cortical+Injury.">Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury.</a> PLoS ONE. 8 (9), 74039 (2013).</li><li>Guti&#233;rrez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sibling+astrocytes+share+preferential+coupling+via+gap+junctions.">Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions.</a> Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).</li><li>Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+promoter+elements+required+for+region-specific+and+astrocyte-specific+expression.">GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.</a> Glia. 56 (5), 481-493 (2008).</li><li>Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex.">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Figueres-O&#241;ate, M., Garc&#237;a-Marqu&#233;s, J., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UbC-StarTrack,+a+clonal+method+to+target+the+entire+progeny+of+individual+progenitors.">UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors.</a> Scientific Reports. 6 (1), 33896 (2016).</li><li>Figueres-O&#241;ate, M., Garc&#237;a-Marqu&#233;s, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analyses+of+neural+lineages+after+embryonic+and+postnatal+progenitor+targeting+combining+different+reporters.">Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 87 (2015).</li><li>Figueres-O&#241;ate, M., S&#225;nchez-Villal&#243;n, M., S&#225;nchez-Gonz&#225;lez, R., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Tracing+and+Cell+Potential+of+Postnatal+Single+Progenitor+Cells+In+Vivo.">Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).</li><li>Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensible+visualization+and+analysis+for+multidimensional+images+using+Vaa3D.">Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D.</a> Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).</li><li>Peng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+finger+boosts+three-dimensional+imaging+and+microsurgery+as+well+as+terabyte+volume+image+visualization+and+analysis.">Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis.</a> Nature Communications. 5 (1), 4342 (2014).</li><li>Loulier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Cell+and+Lineage+Tracking+with+Combinatorial+Labels.">Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels.</a> Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Abdeladim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+multiscale+brain+imaging+with+chromatic+multiphoton+serial+microscopy.">Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy.</a> Nature Communications. 10 (1), 1662 (2019).</li><li>Chen, F., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+stable+transgenesis+of+radial+glia+lineage+in+rat+neocortex+by+piggyBac+mediated+transposition.">A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).</li><li>Siddiqi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+by+PiggyBac+Transposase+Reveals+That+Neocortical+GLAST++Progenitors+Generate+More+Astrocytes+Than+Nestin++Progenitors+in+Rat+Neocortex.">Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+Improved+Tools+for+In+Utero+Electroporation+Studies+of+Developing+Cerebral+Cortex.">New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex.</a> Cerebral Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Genetic+Manipulation+of+Dendrites+and+Spines+in+the+Mouse+Cerebral+Cortex+and+Hippocampus+using+in+utero+Electroporation.">Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4163 (2012).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’électroporation in utero (IUE) des marqueurs MAGIQUEs chez les progéniteurs corticals (figure 1) a permis l’étiquetage des astrocytes dans tout le cortex cérébral postnatal à différents stades postnatals (P4-P7-P21, figure 2). Fait intéressant, le stade de l’IUE n’est pas critique, car l’électroporation effectuée de E13.5 à E15.5 donne des modèles d’étiquetage similaires concernant les astrocytes corticals14. Ce...

Les astrocytes jouent de nombreuses fonctions vitales dans le développement du cerveau et laphysiologie 1. Outre leur rôle à la barrière hémono-encéphalique où ils régulent l’absorption des nutriments et le flux sanguin, ils contribuent activement à la formation et à la fonction de la synapse tout en produisant des neuromodulateurs qui peuvent modifier l’activité neuronale et lecomportement 2. En outre, le dysfonctionnement d’astrocyte contribue à une série de désordres neurologiques3. Les astrocytes situés dans le cortex cérébral présentent une morphologie élaborée permettant un contact étendu avec les processus neuronaux. Ces contacts, essentiels à la fonction du circuit, contrôlent également la morphogenèse et la synaptogenèse des astrocytes par le biais de protéines d’adhérencecellulaire 4. Les neuroscientifiques ont besoin d’outils pratiques et robustes pour étudier le développement des astrocytes et la morphogenèse dans leurs modèles neurologiques d’intérêt. Cependant, en raison de l’apposition étroite des astrocytes à leurs voisins et de leur carrelage tridimensionnel uniforme, il est difficile d’étiquetant les astrocytes corticaux et d’évaluer globalement leur morphologie à l’aide d’immunomarqueurs.
Actuellement, deux stratégies principales de génie génétique permettent l’étiquetage et l’individualisation des astrocytes corticals in situ : l’activation clairsemée de journaliste dans les lignes transgéniques de souris ou la transgenèse somatique utilisant l’électroporation des plasmides de journaliste. La première stratégie repose sur l’élevage d’une ligne de souris reporter floxed avec des souris exprimant une forme inductible de Cre recombinase activé spécifiquement dans les astrocytes lors de la livraison de tamoxifène (par exemple, Aldh1l1-CreERT25). Plusieurs inconvénients sont associés à cette stratégie. Tout d’abord, la reproduction de souris transgéniques nécessite un grand nombre d’animaux et de multiples analyses sont généralement nécessaires pour déterminer la bonne dose de tamoxifène pour fournir une étiquetage suffisamment clairsemée des astrocytes corticals. L’analyse des phénotypes corticals d’astrocyte dans un modèle génétique de souris d’intérêt exigera encore plus d’élevage et de consommation de souris. En outre, l’injection in utero tamoxifène est connue pour interférer avec la parturition, ce qui rend cette stratégie difficile à appliquer à l’étude des premiers stades du développement des astrocytes. L’électroporation in vivo de l’ADN est une stratégie alternative sans tamoxifène qui repose sur un nombre minimum d’animaux6. Réalisée à des stades embryonnaires ou postnatals, cette approche consiste à injecter des plasmides reporter dans les ventricules latéraux des rongeurs suivis d’impulsions électriques qui créent des pores dans la membrane cellulaire, permettant ainsi à l’ADN d’entrer dans les cellules progénitrices tapissant le ventricule. Par la suite, les transgènes reporter transportés par les plasmides électroporés sont traités par les machines cellulaires ciblées etexprimés 7. Deux méthodes d’électroporation ont été précédemment décrites pour étiqueter les astrocytes corticals de souris : 1) étiquetage postnatal d’astrocyte par électroporation (PALE), qui s’appuie sur l’électroporation des plasmides épisomal monocolores de reporter de 1-2 aux étapes postnatalestôt 4; 2) La stratégie StarTrack basée sur l’électroporation in utero (IUE) de plusieurs plasmides reporter intégrateur monocolore8,9,10. Bien que ces deux techniques étiquettent efficacement la PrA dans le cortex cérébral, elles présentent également certaines limitations. Dans leur version initiale, les deux méthodes s’appuient sur un promoteur glial de protéine acide fibrillaire (GFAP) pour conduire l’expression dans les astrocytes, qui peuvent biaiser l’étiquetage vers les gliales radiales aussi bien que les astrocytes piaux et réactifs qui expriment GFAP plus fortement que pra de repos normal11,12. En ce qui concerne pale, d’autres inconvénients sont le stade tardif de l’électroporation, qui empêche l’étiquetage de prA tôt-né (ou ceux provenant des progéniteurs délaminating tôt) et l’analyse des premiers stades du développement d’astroglia, et l’utilisation des vecteurs épisomal qui deviennent dilués par des divisions successives pendant la prolifération massive que PrA subissent pendant la première semaine postnatale13,14. Contrairement à PALE, StarTrack est basé sur l’électroporation embryonnaire des plasmides de reporter intégratifs qui permettent de suivre la contribution des progéniteurs embryonnaires et postnatals à la PrA. Un système StarTrack mis à jour en s’appuyant sur le promoteur ubiquitine C (UbC-StarTrack) réalise une expression plus large des reporters fluorescents dans la descente neuronale et gliaë (astrocytes inclus) des progéniteurs neuronaux15,16,17. Toutefois, dans sa version actuelle, la mise en œuvre de cette approche est complexe, car elle repose sur un mélange équimolaire de 12 plasmides distincts exprimant six protéines fluorescentes (FP) avec excitation partielle et chevauchement des spectres d’émission.
Présenté ici est une simple méthode d’étiquetage multicolore à base d’électroporation utero en utilisant des constructions de journaliste intégrateur conduit par un promoteur fort et largement actif pour étiqueter les astrocytes corticals14. En outre, un pipeline facile d’analyse d’image utilisant des logiciels d’analyse d’image sous licence (p. ex., Imaris) et en libre accès (Vaa3D18,19,20)est fourni pour segmenter le volume territorial et l’arborisation des astrocytes, respectivement. Par rapport aux méthodes décrites précédemment, cette stratégie repose uniquement sur 1-2 transgènes intégratifs multicolores Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers ou MM21) dirigés vers le compartiment cytoplasmique et (en option) des cellules nucléaires dont l’expression est pilotée par un promoteur synthétique du CAG composé d’un exhausteur de cytomégalovirus, d’un promoteur de β-actine de poulet et d’un site d’accepteur d’épissage de β-globinede lapin 22. Cela permet l’étiquetage et le suivi des astrocytes corticals, des stades postnatals embryonnaires aux stades postnatals tardifs, indépendamment de l’expressionGFAP 14,23. Chacun de ces transgènes porte les quatre FP distincts suivants : eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP et tdTomato/mCherry, qui présentent un chevauchement spectral minimal qui peut être facilement contourné avec 1) l’acquisition séquentielle de canaux; 2) Puissance d’excitation optimisée et gain de collection ; et 3) Filtres dichroïques spécifiques pour recueillir les fenêtres d’émission fp étroites. La stratégie MM utilise la recombinaisonCre/lox avec une recombinase cre auto-excisable (seCre) pour stimuler l’expression stochastique de fp dans une population cellulaire. Une seule copie de MM transgene exprime FP d’une manière mutuellement exclusive, tandis que plusieurs transgènes donnent lieu à des combinaisons FP, créant des dizaines de teintes distinctes. L’intégration génomique des transgènes est entraînée par le système de transposition piggyBac (PB) ou Tol224,25,26. Par conséquent, grâce à l’électroporation in utero, la boîte à outils MM et la « mosaïque » multicolore qu’elle génère permettent le marquage simultané de plusieurs progéniteurs corticals adjacents et le suivi de leur descente gliale, y compris les astrocytes corticals, sur de longues périodes. Les contrastes de couleurs résultant de l’expression d’un FP distinct permettent de délimiter le contour de la PrA et d’extraire par la suite des informations clés sur leur volume territorial (à l’aide de l’IMARIS) et leur morphologie complexe (à l’aide de Vaa3D). La stratégie multicolore présentée en détail ici est une méthode pratique et robuste qui donne un accès rapide et facile à la surface corticale des astrocytes et à la morphologie chez les souris de type sauvage à différents stades de développement, et est facilement adaptable pour étudier les caractéristiques anatomiques des astrocytes dans les modèles muraux de maladies neurologiques sans utiliser de lignes de reporter transgéniques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.1 Bacteria transformation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5 alpha competent cells</td>
			<td>Fisher Scientitic</td>
			<td>11563117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice box</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>139959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>Fisher Scientitic</td>
			<td>11563117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish- 10 cm</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>462-0556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 Plasmid culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml culture tube</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>187262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass erlenmeyer- 2L</td>
			<td>Fisher Scientitic</td>
			<td>11383454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3 Plasmid DNA preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi Plus EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740426.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1 Preparation of the solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 1/2 needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>8AN2613R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2 needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>8AN3013R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use polypropylene syringe, 1 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2 Preparation of the surgery material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps - DeBakey Pattern- 12.5 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>11617-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arched tip Forceps- 10 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>11071-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette 1 mm diameter</td>
			<td>FHC</td>
			<td>10-10-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>11651-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>11650-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors - Delicate Straight- 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory tape</td>
			<td>Fisher Scientitic</td>
			<td>11730454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>INJECT+MATIC</td>
			<td>No catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder - 12 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical fiber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic-coated white paper</td>
			<td>Distrimed</td>
			<td>700103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signagel electrode gel</td>
			<td>Free-Med</td>
			<td>15-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dish- 35 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>056714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, glass dry bead, Steri 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.3 Preparation of the pregnant female mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol pad</td>
			<td>Alcomed</td>
			<td>1731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprecare</td>
			<td>Axience</td>
			<td>0.3 mg/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compress</td>
			<td>tRAFFIN</td>
			<td>70189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Merial</td>
			<td>Imalgene 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular gel</td>
			<td>tvm lab</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RjOrl:SWISS mice</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetadine, 10% solution</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>4337400113B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming pad</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun 2%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 Electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse</td>
			<td>Novosyn</td>
			<td>C0068220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporateur Sonidel</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>NEPA 21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile transfer pipets (individually wrapped)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>043202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY650P3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 Tissue harvesting and sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigenfix</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>U/P0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>100266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolethal</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>DOL202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11540486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Multichannel confocal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X oil NA 0.85</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 20x/0.8 M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Astrocyte territorial volume segmentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 8.3 and later versions</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7. Astrocyte arborization tracing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D)</td>
			<td>HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (magic) markers to individualize cortical mouse astrocytes

Les astrocytes protoplasmiques (PrA) situés dans le cortex cérébral de la souris sont étroitement juxtaposés, formant une matrice tridimensionnelle apparemment continue aux stades adultes. Jusqu’à présent, aucune stratégie d’immunostaining ne peut les entacher et segmenter leur morphologie chez les animaux matures et au cours de la corticogenèse. La PrA corticale provient d’progéniteurs situés dans le pallium dorsale et peut facilement être ciblée à l’aide de l’électroporation in utero des vecteurs intégrateurs. Un protocole est présenté ici pour étiqueter ces cellules avec la stratégie multiaddressable de marqueurs de couleur intégrant le génome (MAGIC), qui s’appuie sur la transposition piggyBac/Tol2 et la recombinaisonCre/lox pour exprimer stochastically des protéines fluorescentes distinctes (bleu, cyan, jaune et rouge) adressées à des compartiments subcellulaires spécifiques. Cette stratégie de cartographie du destin multicolore permet de marquer in situ les progéniteurs corticals à proximité avec des combinaisons de marqueurs de couleur avant le début de la gliogenèse et de suivre leurs descendants, y compris les astrocytes, des stades embryonnaires aux stades adultes au niveau cellulaire individuel. L’étiquetage semi-clairsemé obtenu en ajustant la concentration des vecteurs électroporés et des contrastes de couleurs fournis par les marqueurs de couleur multiaddressables intégrant le génome (marqueurs MAGIQUEs ou MM) permet d’individualiser les astrocytes et de étiqueter leur territoire et leur morphologie complexe malgré leur arrangement anatomique dense. Présenté ici est un workflow expérimental complet comprenant les détails de la procédure d’électroporation, l’acquisition de piles d’images multicanaux par microscopie confocale, et la segmentation tridimensionnelle assistée par ordinateur qui permettra à l’expérimentateur d’évaluer le volume et la morphologie individuels de PrA. En résumé, l’électroporation des marqueurs MAGIQUEs fournit une méthode pratique pour étiqueter individuellement de nombreux astrocytes et accéder à leurs caractéristiques anatomiques à différents stades de développement. Cette technique sera utile pour analyser les propriétés morphologiques corticales des astrocytes dans divers modèles muraux sans recourir à des croisements complexes avec des lignes de reporter transgéniques.

L’électroporation des marqueurs MAGIQUEs chez les progéniteurs corticals embryonnaires permet l’étiquetage des astrocytes des stades précoces à avancés du développement du cortex cérébral (figure 1). Ces astrocytes ont été trouvés dans toutes les couches corticales à divers stades postnatals (P4, P7, P21) car ils se sont dispersés largement dans le cortex cérébral entier. Ils ont été évalués à l’aide d’images confoccales carrelées acquises avec un objectif de 20...

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In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Les astrocytes tuent uniformément le cortex cérébral, rendant l’analyse de leur morphologie complexe difficile au niveau cellulaire. Le protocole fourni ici utilise l’étiquetage multicolore basé sur l’électroporation in utero pour étiqueter les astrocytes corticaux et analyser leur volume et leur morphologie avec un pipeline d’analyse d’image convivial.

Électroporation in Utero de marqueurs multiaddressables intégrant la couleur du génome (MAGIC) pour individualiser les astrocytes corticals de souris

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

5.3K vues.  Institut des Neurosciences de Montpellier. Les astrocytes tuent uniformément le cortex cérébral, rendant l’analyse de leur morphologie complexe difficile au niveau cellulaire. Le protocole fourni ici utilise l’étiquetage multicolore basé sur l’électroporation in utero pour étiqueter les astrocytes corticaux et analyser leur volume et leur morphologie avec un pipeline d’analyse d’image convivial.

Vidéo: In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Recherche

Neurosciences

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l&#39;aide In Utero L&#39;électroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolement et culture des astrocytes corticaux de souris

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Génération de rats transgéniques par voie topique<em&gt; In utero</em&gt; L&#39;électroporation et<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence dépistage

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Manipulation génétique de la souris en développement à travers l&#39;hypothalamus<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Sous-sélective électroporation corticaux Interneurones

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero électroporation approches pour étudier l&#39;excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...