Ce protocole utilise trois approches pour déterminer si la fumée de cigarette affecte la charge bactérienne pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires. Cette méthode peut être étendue aux cellules endothéliales ou à d’autres robinets cellulaires. La préparation de l’extraction de la fumée de cigarette, l’infection bactérienne et la détermination avec une charge bactérienne sont bien décrites en détail dans cette vidéo.
Cette procédure est très facile à suivre pour les nouveaux utilisateurs. Dessinez 10 millilitres de milieu de culture cellulaire sans sérum dans une seringue de 60 millilitres. Fixez l’extrémité étroite d’une garniture à une pointe de pipette millilitre à la buse de la seringue, comme adaptateur pour tenir la cigarette.
Retirez le filtre de la cigarette et attachez la cigarette à l’adaptateur. Pas plus de 30 minutes avant d’effectuer l’analyse de combust la cigarette et dessiner 40 millilitres de fumée contenant de l’air dans la seringue. Mélanger la fumée avec le milieu en secouant vigoureusement la seringue.
Répétez le processus de dessin jusqu’à ce que la cigarette soit complètement brûlée, ce qui nécessitera environ 11 tirages en environ sept minutes. Pour éliminer les micro-organismes et les particules insolubles du milieu, filtrez-les à travers un filtre de 0,22 micron. Ensuite, transférer le milieu dans un tube stérile fermé.
Inoculer un bouillon de syxtique tryptique ou une plaque d’auger TSB avec une souche de pseudomonas sélectionnée. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Préparez un tube contenant 20 millilitres de BST avec 5 % de glycérol comme source de carbone.
Recueillir un frottis dans la plaque de la tarière et inoculer le BST. Incuber la suspension des pseudomonas dans un shaker de 37 degrés Celsius à 200 RPM, pendant environ une heure, jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres soit de 0,6. Après la culture des cellules épithéliales pulmonaires telles que décrites dans le manuscrit, ajouter un millilitre de trypsine de 0,25% aux cellules.
Après environ cinq minutes, lorsque les cellules se sont complètement détachées du fond de la plaque, ajouter 10 millilitres de hauteurs complètes moyennes pour neutraliser la trypsine. Transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et 300 fois G.Retirez et jetez le supernatant.
Ensuite, re-suspendre les cellules en millilitres de hauteurs moyennes avec 10%FBS. Pipette 10 microlitres de la suspension épithéliale de cellules sur une nouvelle plaque. Utilisez un compteur cellulaire automatisé pour obtenir la concentration cellulaire.
Plaquez les cellules épithéliales pulmonaires à une concentration de trois fois 10 à la cinquième cellule par millilitre, dans un volume total de deux millilitres de milieu par puits. Incuber les assiettes toute la nuit. Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence, remplacez le milieu par des hauteurs moyennes, plus 1%FBS.
Ensuite, ajoutez 4% de CSE aux puits et incubez les plaques pendant trois heures. Ajouter un pseudomonas à chaque puits de cellules épithéliales pulmonaires traitées par le CST. Ensuite, incuber les plaques pendant une heure à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Ensuite, remplacez le milieu dans les six plaques de puits par deux millilitres de hauteurs fraîches moyennes, contenant 4% de CSE et 100 microgrammes par millilitre de gentamycine. Après avoir couver les plaques pendant une heure à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, aspirer le milieu des puits. Lavez les cellules traitées à la gentamycine, deux fois, avec deux millilitres de PBS froid.
La charge bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires peut alors être détectée par la méthode de la plaque de chute, qRT-PCR, ou cytométrie d’écoulement. Ajouter un millilitre de tampon de lyse cellulaire à chaque puits de cellules épithéliales pulmonaires. Réparer les dilutions en série du lysate cellulaire, allant de 1 à 10 à 10 000.
Puis inoculer la plaque d’auger du BST. Après 16 heures d’incubation, déterminer combien d’unités de formation de colonies étaient présentes dans les cellules épithéliales pulmonaires, en comptant le nombre de colonies bactériennes. Ajouter 0,35 millilitres du tampon de lyse de thiocyanate de guanidinium à chaque puits de cellules épithéliales pulmonaires.
Recueillir les cellules avec un grattoir cellulaire. Pipette le lysate dans un tube de micro-centrifugeuse et mélanger doucement avec la pipette. Ajouter 0,35 millilitres de fraîchement préparé à 70% d’éthanol au lysate et bien mélanger.
Transférer tous les échantillons dans une colonne de spin placée dans un tube de collecte de deux millilitres. Centrifugeuse le tube de collecte pendant 30 secondes à 10 000 fois G et 20 à 25 degrés Celsius. Jetez le tampon dans le tube de collecte et lavez la colonne avec 0,7 millilitres de tampon de lavage.
Centrifuger la colonne à 10 000 fois G pendant 30 secondes. Lavez la colonne deux fois avec 0,5 millilitres de tampon. Répétez la centrifugation à 10 000 fois G pendant deux minutes.
Placez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 1,5 millilitre et ajoutez de 30 à 50 microlitres d’eau sans RNase. Après avoir centrifugé le tube à 10 000 fois G pendant une minute, recueillir le flux à travers et mesurer la concentration d’ARN. Pour se préparer à une réaction de transcription inverse de 20 microlitres fait un microgramme d’ARN total avec 10 microlitres de tampon de réaction, un microlitre de transcriptase inverse et de l’eau sans RNase.
Effectuer la réaction de transcription inverse à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, selon le protocole du fabricant. Mélangez ensuite un microlitre de chaque échantillon d’ADNC avec cinq microlitres du mélange principal contenant du colorant cyber et un microlitre de chaque amorce spécifique de 200 nanomolaires. Ajouter de l’eau pour un volume total de 20 microlitres.
Effectuer l’analyse PCR, selon les recommandations du fabricant. Ensuite, utilisez la méthode comparative CT pour déterminer l’expression. Dans les cellules BEAS-2B, la viabilité n’a pas changé considérablement quand les cellules ont été traitées avec 4%CSE pendant trois heures.
Une heure comme infection de pseudomonas n’a pas non plus sensiblement affecté la viabilité. Enfin, ils utilisent de la gentamycine pour tuer les pseudomonas dans le milieu de la culture n’a pas eu un effet statistiquement significatif sur la viabilité cellulaire. Comme mesuré par la méthode de plaque de chute, l’infection bactérienne dans les cellules de BEAS-2B a été sensiblement augmentée par le traitement avec le CST.
Il en va de même pour le traitement par le CSE du HSAEC. L’infection bactérienne des cellules BEAS-2B traitées par le CST a également été évaluée en utilisant rt-PCR pour quantifier la quantité de 16S rRNA présent, qui a indiqué une augmentation de Pseudomonas aeruginosa. Les cellules BEAS-2B traitées avec le CST et infectées par pseudomonas fluorescens Migula ont été analysées par cytométrie d’écoulement à 509 nanomètres.
Le résultat a également indiqué que le traitement de CSE augmente l’infection bactérienne. Les résultats de la microscopie fluorescente ont montré que les bactéries étiquetées GFP co-localisées avec les cellules BEAS-2B dans une expérience pseudomonas fluorescens Migula infection. Les cellules pourraient être exposées à la fumée de cigarette avec des robots fumant, ce qui peut imiter le comportement humain et rendre possible d’étudier directement les effets de la fumée de cigarette sur les cellules épithéliales pulmonaires.
Cette technique pourrait être utilisée pour explorer une fumée de cigarette sur d’autres robinets cellulaires dans le contexte d’une infection pulmonaire. L’approche décrite pour être à la base du développement de thérapies efficaces contre une lésion pulmonaire dorsale de tabagisme et C0PD supplémentaire
