Ce protocole est une méthode robuste et rentable qui peut être utilisée pour répondre à une variété de questions de recherche liées à la fonction et au rôle des cellules épithéliales des voies respiratoires dans la santé et la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle donne une couche cellulaire qui représente bien la couche de cellules épithéliales humaines, y compris la production de mucus et l’activité ciliaire. Cette technique est polyvalente et peut être utilisée pour étudier les insultes liées à la maladie ou les thérapies.
Pour commencer, rincez l’anneau bronchique isolé du tissu pulmonaire humain avec 10 millilitres de PBS stérile dans une boîte de Petri de 10 centimètres. Tout en tenant l’anneau avec une pince à épiler, utilisez de petits ciseaux pour enlever tout excès de tissu conjonctif et de restes de sang. Couper l’anneau en deux et plonger deux moitiés dans 10 millilitres de solution de protéase 14 préchauffée dans HBSS contenant Primocin dans un récipient stérile fermé.
Incuber les pièces de l’anneau bronchique à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après l’incubation, transférer les morceaux dans une boîte de Petri contenant 10 millilitres de PBS chaud et, à l’aide d’une pince à épiler pliée, gratter l’intérieur de l’anneau pour obtenir une solution cellulaire. Jetez l’anneau.
Transférer la solution cellulaire dans un tube de 50 millilitres et ajouter du PBS chaud pour obtenir un volume final de 50 millilitres. Centrifuger la solution cellulaire et aspirer le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 10 millilitres de PBS chaud. Porter le volume à 50 millilitres avec du PBS et répéter la centrifugation.
Re-suspendre la pastille dans du KSFM complet chaud contenant de la Primocine. Ensuite, remplacez la solution de revêtement de la plaque à six puits par deux millilitres de suspension cellulaire par puits. Laisser les cellules se développer jusqu’à ce que la confluence soit atteinte de 80 à 90%, Pour la cryoconservation des PBEC, aspirer le milieu des puits et laver les cellules une fois avec deux millilitres de PBS chaud par puits.
Trypsiniser les cellules en ajoutant 500 microlitres de trypsine molle par puits, et incuber pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius. Faire tourbillonner la solution de trypsine et libérer les cellules en tapotant doucement la plaque. Transférer les cellules détachées dans un tube centrifuge de 50 millilitres contenant un inhibiteur de trypsine de soja.
Centrifuger la suspension et jeter le surnageant avant de remettre en suspension la pastille dans 10 millilitres de KSFM contenant de la pénicilline et de la streptomycine. Après avoir compté les cellules sur un compteur de cellules automatisé, re-suspendre les cellules à une concentration de 400 000 cellules par millilitre dans un milieu de congélation et ajouter un millilitre de cette suspension dans un cryovial. Transférer les flacons dans un récipient à cellules froides et le placer à moins 80 degrés Celsius.
Après 24 heures, transférer les flacons à moins 196 degrés Celsius azote liquide pour un stockage à long terme. Pour enduire un flacon de culture cellulaire T75, ajouter 10 millilitres de solution d’enrobage dans du PBS et fermer hermétiquement le couvercle avant de placer le ballon dans un incubateur à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez la solution de revêtement du ballon par 10 millilitres de KSFM complet.
Laissez le milieu se réchauffer à 37 degrés Celsius dans l’incubateur avec un couvercle légèrement ouvert pour laisser entrer l’air de l’incubateur. Décongeler rapidement les PTEC cryoconservés dans un bain de perles de 37 degrés Celsius. Ajouter la totalité du contenu au cryovial dans la fiole T75 préchauffée et répartir uniformément les cellules.
Après vous être assuré que les cellules sont fermement attachées, remplacez le milieu par 10 millilitres de KSFM complet frais et chaud et cultivez-les jusqu’à ce que la confluence soit atteinte à 80 à 90%. Enduire les inserts de culture cellulaire en ajoutant 400 microlitres de solution d’enrobage par insert et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Trypsiniser les PCE dans la fiole en ajoutant deux millilitres de trypsine molle et incuber pendant cinq à 10 minutes.
Faciliter le détachement des cellules en faisant tourbillonner et en tapotant doucement la fiole. Ensuite, ajoutez quatre millilitres d’inhibiteur de trypsine de soja dans le flacon et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 25 millilitres. Centrifuger la suspension et remettre en suspension la pastille dans six millilitres de milieu BD complet.
Comptez les cellules sur un compteur de cellules automatisé. Après le revêtement, retirez la solution de revêtement des inserts. Diluer la suspension cellulaire avec un milieu BD complet complété par une nanomole EC 23 et ajouter 500 microlitres sur le dessus de la membrane des inserts.
Ajouter 1,5 millilitre de milieu BD complet dans le puits sous l’insert. Lorsque les cellules sont prêtes à être transférées à l’interface air-liquide, ou ALI, retirez le milieu des inserts et du puits, et ajoutez un nouveau milieu BD complet complété par 50 nanomolaires EC 23 uniquement au puits. Changez le milieu dans les puits trois fois par semaine.
Pour éliminer l’excès de mucus et de débris cellulaires, ajoutez doucement 200 microlitres de PBS chaud sur la face apicale de la couche cellulaire à l’intérieur de l’insert et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, aspirer le PBS contenant l’excès de mucus et de débris cellulaires. TEER a été mesuré pour évaluer la qualité des cultures PBEC ALI.
À sept jours, la résistance électrique de la couche cellulaire supérieure à 300 ohms est considérée comme une culture réussie. De plus, la variabilité inter-donneurs de la résistance électrique a diminué au fil du temps entre le septième et le jour 14 de culture à l’interface air-liquide, et est nettement influencée par l’origine du DMEM utilisé. Tous les principaux types de cellules, telles que les cellules basales, ciliées, gobelets et massues, ont été observés après 14 jours de culture ALI, et les niveaux d’expression dépendaient du donneur.
Parmi les différentes concentrations d’EC 23 testées, le TEER maximal a été observé à 50 nanomolaires. Une comparaison de l’acide rétinoïque et de son analogue synthétique, EC 23, confirme que l’expression génique des marqueurs des cellules ciliées et caliciformes était similaire entre 50 nanomolaires EC 23 et l’acide rétinoïque. L’utilisation de supports provenant de différents fournisseurs a entraîné des différences substantielles dans la composition cellulaire, tandis que les différences dans le TEER étaient moins prononcées.
D’autre part, l’utilisation d’inserts de différents fournisseurs n’a pas entraîné de différences substantielles dans la décomposition cellulaire. De plus, une différence dans les valeurs TEER et la composition cellulaire de l’ALI PBEC et du milieu PneumaCult par rapport au milieu BD complet a également été observée. Lorsque les cellules sont prêtes à être transférées à l’ALI, augmenter les concentrations EC 23.
De plus, ne centrifugez pas les cellules après la décongélation et retirez rapidement les cellules des plastiques de culture cellulaire après avoir ajouté SBTI. En utilisant des cultures de cellules épithéliales des voies respiratoires de la manière prévue dans ce protocole, vous pouvez suivre cela en utilisant une variété de méthodes d’analyse pour examiner, par exemple, la fonction, l’expression des gènes, la production de médiateurs des cellules épithéliales des voies respiratoires, et ainsi, par exemple, obtenir un aperçu des conséquences de l’exposition, par exemple, à la fumée de cigarette. Les prochaines étapes de ce protocole de culture cellulaire sont l’intégration de types cellulaires supplémentaires, tels que les cellules immunitaires ou les cellules vasculaires, ce qui contribuera à augmenter la représentation tissulaire.
