Cette méthode permet de fournir l’expression de microARN dans les reins des souris avec un large éventail de conditions pathologiques, telles que la fibrose rénale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet le profilage d’expression microARN avec une grande précision et sensibilité en utilisant un processus simple qui permet de gagner du temps et d’éviter les erreurs techniques. Pour effectuer la chirurgie simulée, utilisez des ciseaux chirurgicaux et des pinces à épiler pour faire une incision dans la peau à l’abdomen et couper le muscle et la membrane péritonéale de la vessie au bord inférieur gauche des côtes.
Humidifier deux cotons-tiges avec PBS et tirer soigneusement les intestins sur le côté. Placez les écouvillons humidifiés pour identifier le rein gauche et l’uretrée. Fermer la membrane péritonéale, puis l’incision avec du nylon 4-0.
Pour effectuer l’obstruction urétrale unilatérale, ou UUO, faire une incision dans la peau à l’abdomen et couper le muscle et la membrane péritonéale comme démontré pour la chirurgie simulée. Placez une seringue de 2,5 millilitres sous la souris. Humidifiez deux cotons-tiges avec du PBS, puis tirez soigneusement les intestins sur le côté avec les pinces et placez les écouvillons pour identifier l’uretères gauche.
Utilisez la pince à épiler pour soulever le rein gauche. Utilisez de la soie 4-0 pour ligate l’uretier gauche à deux endroits à environ un centimètre l’un de l’autre. Couper l’uretère au point central des deux ligatures, puis utiliser des sutures de nylon 4-0 pour fermer la membrane péritonéale et l’incision.
Après avoir coupé la membrane péritonéale, comme démontré précédemment, soulevez-la avec des pinces à épiler et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision latérale au bord supérieur, puis continuez l’incision le long du bord le plus bas des côtes. Identifiez le rein gauche et reflux avec PBS jusqu’à ce que le rein devient jaune-blanc. Retirez le rein en coupant l’artère rénale gauche et la veine avec les ciseaux chirurgicaux et placez-le dans une boîte de Pétri, puis lavez-le soigneusement avec PBS.
Couper le rein en échantillons d’environ 10 milligrammes avec les ciseaux chirurgicaux et les pinces à épiler, mettre chaque morceau du rein dans son propre tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et fermer le bouchon du tube. Mettre un échantillon de rein dans l’homogénéiseur en silicone et ajouter 700 microlitres d’un phényle / guanidine à base de lyse reagent. Appuyez lentement et tordez le pilon de l’homogénéisateur contre l’échantillon rénal pour l’homogénéiser.
Répétez le pressage et la torsion jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement dissous dans le reagent de lyse. Pour homogénéiser davantage l’échantillon, transférez le lysate homogénéisé à la colonne de spin biopolymère et tournez-le à 14 000 fois G pendant trois minutes, puis transférez le lysate précipité dans un tube de microcentrifugeuse inutilisé de 1,5 millilitre. Mélanger le lysate dans le tube avec 140 microlitres de chloroforme et bien capifier le tube.
Pour mélanger le lysate et le chloroforme, inverser le tube 15 fois. Incuber les échantillons pendant deux à trois minutes à température ambiante, puis les faire tourner à 12 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Sans perturber le précipité, transférez le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et ajoutez 1,5 fois son volume de 100 % d’éthanol.
Vortex le mélange pendant cinq secondes. Chargez 700 microlitres de l’échantillon sur une colonne de spin à ancrage membranaire dans un tube de collecte de deux millilitres. Fermez le capuchon de colonne et faites tourner la colonne à 15 000 fois G pendant 15 secondes, puis jetez le lysate précipité dans le tube de collecte.
Lavez soigneusement l’échantillon en ajoutant 700 microlitres de tampon de lavage un à la colonne de spin ancré par membrane dans un tube de collecte de deux millilitres. Répétez ensuite la centrifugation et jetez le tube de collecte. Répétez le lavage deux fois avec 500 microlitres de tampon de lavage deux par lavage.
Après le dernier lavage, faites tourner la colonne de spin ancrée dans un tube de collecte de deux millilitres à 15 000 fois G pendant une minute et jetez le lysate précipité. Transférer la colonne de spin ancré par membrane dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Dissoudre l’ARN total en ajoutant 30 microlitres d’eau sans RNase à la colonne, fermer le bouchon de colonne et le laisser pendant cinq minutes à température ambiante.
Ensuite, faites tourner la colonne à 15 000 fois G pendant une minute. Transférer l’échantillon contenant l’ARN total dans un nouveau tube de microcentrifugeuse sur la glace et mesurer la concentration totale d’ARN par spectrophotométrie. Préparez une solution de mélange maître selon les instructions manuscrites et ajoutez huit microlitres à chaque tube d’une bande de tube de huit puits.
Après ajustement de la densité totale de l’ARN, placez un aliquot de 12 microlitres d’ARN total dans chaque tube et fermez le bouchon. Centrifuger les tubes pendant 15 secondes. Mettez les tubes dans le thermocycleur et incubez-les pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius.
Une fois terminés, incubez-les immédiatement pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius pour la synthèse de l’ADN. Transférer l’ADRC dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et le diluer 10 fois avec de l’eau distillée. Vortex et centrifugeuse du tube pendant cinq secondes, puis effectuer quantitative en temps réel PCR, tel que décrit dans le manuscrit du texte.
Ce protocole a été employé pour créer un modèle unilatéral de souris d’obstruction urétrale par ligature urétrale gauche dans les souris mâles de huit semaines pesant 20 à 25 grammes. Les uretères ont été complètement obstrués par la double ligature avec des sutures de soie 4-0. Des reins ont été rassemblés à huit jours après chirurgie.
Les données qRT-PCR de microARN ont indiqué que le niveau de microARN 3070-3p a été sensiblement augmenté et les niveaux de microARN, 7218-5p et microARN 7219-5p ont été diminués dans les reins des souris d’UUO comparées aux contrôles. Lorsque vous essayez ce protocole, n’oubliez pas de répéter la torsion de l’échantillon de rein jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous dans le reagent de lyse à base de phényle/guanidine pour obtenir une bonne extraction d’ARN.
