Cette méthode qRT-PCR peut répondre à des questions liées au profilage de l’expression des microARN dans le sérum de souris dans des conditions telles que l’insuffisance rénale dépendante de l’âge. La technique permet la détection de l’expression des microARN avec une grande précision et sensibilité par un processus simple qui permet de gagner du temps et d’éviter les erreurs techniques. Pour commencer, incisez la peau de l’abdomen à l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux chirurgicaux.
Coupez les muscles de la membrane péritonéale de la vessie au bord inférieur gauche des côtes. Soulevez la membrane péritonéale à l’aide d’une pince à épiler et faites une incision latérale dans le bord supérieur avec des ciseaux chirurgicaux. Continuez l’incision le long du bord inférieur des côtes.
Identifier la veine cave inférieure en utilisant deux cotons-tiges humidifiés au PBS. Insérez une aiguille de 30 G fixée à une seringue de 1 millilitre dans la veine cave inférieure et tirez la seringue. Retirez lentement l’aiguille pour éviter l’hémolyse.
Transférer le sang dans un tube à bec de 1 millilitre avec de l’héparine et mélanger en inversant. Centrifuger le tube à bec pendant 10 minutes à 3000 fois G à température ambiante. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.
Prélevez 200 microlitres d’échantillon de sérum et ajoutez 1 000 microlitres de réactif de lyse à base de phénol/guanidine. Tourbillonner le mélange pendant 5 secondes et incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Ajouter 200 microlitres de chloroforme et mélanger en retournant le tube 15 fois.
Incuber l’échantillon à température ambiante pendant 3 minutes, puis procéder à une centrifugation. Sans déranger la pastille, transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajouter 450 microlitres d’éthanol à 100% et vortex le tube pendant 5 secondes.
Ensuite, chargez 700 microlitres de l’échantillon sur une colonne de spin ancrée à membrane et centrifugez-la. Jetez le flux continu et ajoutez 700 microlitres de Wash Buffer 1 fourni dans le kit. Centrifuger à nouveau et jeter l’écoulement.
Répétez le lavage avec 500 microlitres de Wash Buffer 2 pour éliminer les sels traces. Ajouter 500 microlitres d’éthanol à 80%, centrifuger et éliminer le flux continu du tube de collecte. Centrifugez à nouveau la colonne de spin et transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 1,5 millilitre.
Ajoutez ensuite 14 microlitres d’eau sans RNase et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Faites tourner la colonne à nouveau pendant 1 minute à 15000 fois G à température ambiante. Préparer une solution de mélange principal et ajouter 8 microlitres par puits dans un tube à bande de 8 puits.
Ajouter 12 microlitres de l’ARN total extrait dans chaque tube, et centrifuger le tube pendant 15 secondes à 2000 fois G à température ambiante. Placez le tube dans un cycleur thermique et commencez l’incubation pour synthétiser l’ADNc. Après l’incubation, transférer l’ADNc dans un nouveau tube microcentrifugeux.
Diluer l’ADNc dix fois avec de l’eau distillée. Puis vortex, suivi d’une centrifugation pendant 5 secondes à 2000 fois G à température ambiante. Dans un tube à microcentrifugation, préparer la solution de mélange principal comme décrit dans le protocole de texte, et vortex la solution.
Ajouter 22,5 microlitres aliquotes dans chaque puits d’une plaque de 96 puits, suivis de 2,5 microlitres d’ADNc. Scellez la plaque à l’aide d’un film adhésif et centrifugez la plaque pendant 30 secondes à 1000 fois G.Placez la plaque dans le système de PCR en temps réel. Modifiez les paramètres en fournissant un nom pour l’expérience.
Sélectionnez ensuite 96 puits 0,2 millilitre comme type d’expérience, CT comparatif comme méthode de quantification, standard comme mode d’exécution du système et les réactifs SYBR Green comme réactifs pour détecter la séquence cible. Donnez les noms de l’échantillon et du miARN cible dans chaque puits. Attribuez des échantillons en double, choisissez un échantillon de référence et un témoin endogène, puis sélectionnez-en aucun pour le colorant à utiliser comme référence passive.
Pour éliminer la contamination croisée des réactifs, configurez une transcriptase inverse négative et un contrôle sans modèle pour l’expression des miARN. Ensuite, assurez-vous que le volume de réaction est réglé à 20 microlitres et que les conditions de cycle PCR sont réglées à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis 40 cycles de dénaturation à 94 degrés Celsius pendant 15 secondes, recuit à 55 degrés Celsius pendant 30 secondes et extension à 70 degrés Celsius pendant 30 secondes. Une fois le processus terminé, cliquez sur analyser pour analyser les données qRT-PCR.
Confirmez que la ligne de seuil automatiquement sélectionnée par le programme est appropriée pour chaque puits. Vérifier la valeur seuil du cycle du contrôle endogène et des miARN cibles analysés dans chaque échantillon. Déterminer les valeurs CT par l’intersection de la courbe d’amplification et de la ligne de seuil.
Les données qRT-PCR miRNA pour le modèle d’insuffisance rénale dépendante de l’âge ont montré que, par rapport aux souris témoins SAMR1, le taux rénal de miRNA-7219-5p a significativement augmenté chez les souris expérimentales SAMP1, tandis que le niveau rénal de miRNA-7218-5p a diminué. Les niveaux d’expression de miRNA-223-3p n’ont changé dans aucune des souches. Les taux sériques de miRNA-7219-5p et miRNA-7218-5p ont considérablement augmenté chez les souris SAMP1, tandis que les niveaux de miRNA-223-3p sont restés inchangés.
Vous devez insérer l’aiguille dans la veine cave inférieure et extraire le sang sans pénétrer dans le vaisseau. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le profilage de l’expression des microARN dans le sérum de souris pour un large éventail de conditions pathologiques.
