Le but de ce système 3D biomimétique simple reproductible basé sur la cellule est de faciliter l’analyse de capacité d’invasion dans une grande population de sphéroïdes de tumeur pour le criblage anti-métastatique de drogue. Le principal avantage de notre tableau de micro-chambre hydrogel est qu’il permet la production d’un grand nombre de sphéroïdes uniformes qui peuplent le même plan focal par puits. La position sphéroïde est conservée en raison de la structure du réseau hydrogel micro-chambre, même après l’ajout de matrice extracellulaire, facilitant la surveillance continue précise des sphéroïdes et le processus d’invasion.
En outre, la caractérisation morphologique et la coloration fluorescente de nombreux sphéroïdes et cellules envahissantes peuvent être effectuées in situ et analysées à une résolution à un seul élément d’une manière efficace dans le temps. Maria Sobolev, de notre laboratoire, présentera la procédure de production de plaques d’imagerie à six puits hydrogel. Pour préparer les plaques de tableau de micro-chambre hydrogel, préchauffer d’abord six polydimethylsiloxane, ou PDMS, timbres à 70 degrés Celsius, et placer un six puits, plaque de fond de verre sur un bain sec préchauffé à 75 degrés Celsius pendant plusieurs minutes.
Lorsque la plaque est chaude, versez une goutte de 400 microlitres d’agarose préchauffée à faible fond fondant sur le fond de chaque puits de la plaque de six puits, et placez doucement un timbre sur chaque goutte. Laisser refroidir la configuration de cinq à dix minutes à température ambiante, suivie de 20 minutes à quatre degrés Celsius pour une gelation complète de l’agarose. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, décoller délicatement le PDMS de chaque puits, laissant les gels agarose modelés avec des micro-chambres.
Après avoir permis à la lampe UV d’atteindre sa plus grande intensité, placez la plaque en relief dans le système de séchage léger pendant trois minutes et remplissez les macro-puits stérilisés aux UV de PBS stériles. Ensuite, couvrez la plaque et enveloppez-la de parafilm pour un stockage de quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour charger les cellules, retirez le PBS de chaque puits et chargez doucement 50 microlitres des cellules d’intérêt au-dessus de chaque tableau d’hydrogel.
Après avoir permis aux cellules de se déposer par gravité pendant 15 minutes, ajouter soigneusement six à huit aliquots de 500 microlitres de milieu frais au bord du fond en plastique macro-puits à l’extérieur de l’anneau et du tableau hydrogel. Incuber les cellules pendant la période appropriée à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec l’humidité pour la formation de sphéroïdes. Ensuite, transférez les sphéroïdes dans une hotte de biosécurité sur la glace pendant 10 minutes.
Lorsque la plaque est refroidie, penchez une pointe de pipette sur le bord du fond en plastique macro-bien à côté du tableau hydrogel, et retirez tout le milieu autour du tableau. Ensuite, retirez le milieu du réservoir de tableau, penchez une pointe de pipette de gel-chargement sur le bord du réservoir de tableau très soigneusement, prenant soin de ne pas déranger les micro-chambres et les sphéroïdes. Ensuite, utilisez une pointe de pipette fine prégelée pour ajouter deux aliquots de 150 microlitres du mélange de collagène d’intérêt au bord du tableau un à la fois, libérant le mélange lentement pour éviter la dislocation sphéroïde.
Après la deuxième série de collagène a été ajouté à chaque puits, retourner les sphéroïdes à l’incubateur pendant une heure pour la gelation complète de la matrice extracellulaire. Lorsque la matrice s’est solidifiée, ajouter 400 microlitres d’agarose préchauffée de 1 % à faible fondant sur le gel et incuber la plaque, recouverte à température ambiante, pendant cinq à sept minutes, avant de la refroidir pendant deux minutes à quatre degrés Celsius pour une gelation agarose. Puis, en appuyant sur la pipette sur le bord du fond en plastique macro-bien, ajouter délicatement deux millilitres de milieu complet à chaque puits.
Pour effectuer un test d’invasion, chargez la plaque de tableau de microchôle hydrogel sur un stade de microscope inversé motorisé équipé d’un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et de 5 % avec une atmosphère humidifiée, et utilisez un objectif de quatre ou 10 x pour prédéterminer les positions de l’acquisition d’images dans chaque puits afin que l’ensemble de la zone du réseau soit évalué. Ensuite, acquérir des images en champ lumineux toutes les deux à quatre heures pour un total de 24 à 72 heures pour suivre l’invasion cellulaire du corps sphéroïde dans la matrice extracellulaire environnante. À la fin de l’acquisition de l’image, exportez les images en time-lapse du logiciel d’acquisition d’images pour économiser dans un format de fichier d’image marqué vers un dossier dédié.
Ensuite, ouvrez l’interface utilisateur graphique et cliquez sur Load Bright Field. Ajustez les paramètres de segmentation de l’image pour obtenir une segmentation précise des sphéroïdes et de leurs zones d’invasion, et cliquez sur Segmentation région d’intérêt pour créer une bordure autour de chaque sphéroïde. Si la segmentation automatique est incorrecte, appuyez sur Supprimer ou Ajouter, et apporter les corrections appropriées manuellement.
Cliquez sur Suivi pour numéroter les sphéroïdes dans chacune des images time-lapse. Ensuite, cliquez sur Mesure pour générer une feuille de calcul avec tous les paramètres, et enregistrer la feuille de calcul dans un format approprié pour le traitement des données et l’analyse statistique. Pour examiner l’influence de l’acide hyaluronique sur le processus spontané d’invasion sphéroïde HeLa, dans cette expérience, les sphéroïdes mûris de deux jours ont été couverts de collagène et de solution de mélange d’acide hyaluronique et comparés à des sphéroïdes mûris de deux jours couverts de solution de collagène seul.
Après 50 heures d’incubation, les sphéroïdes incorporés dans le collagène et l’acide hyaluronique ont démontré une dispersion cellulaire inférieure dans la matrice extracellulaire environnante par rapport aux sphéroïdes incorporés dans le collagène seul. En effet, l’analyse de la cinétique de la zone d’invasion au fil du temps pour 99 sphéroïdes à résolution monosphéroïde indique clairement que l’ajout d’acide hyaluronique au collagène empêche la dispersion cellulaire hors du sphéroïde, ce qui entraîne de plus petites zones d’invasion. Le traitement de la culture sphéroïde HeLa avec un flavonoïde bioactif avec des propriétés cyto-et migrastatiques pendant 24 heures entraîne une dispersion cellulaire inhibée autour des sphéroïdes par rapport aux sphéroïdes HeLa non traités.
En effet, l’analyse des zones d’invasion de 488 sphéroïdes à la fin de l’expérience a révélé une inhibition significative après traitement avec aussi peu que 10 micromolaires du médicament. En raison de la faible caractéristique d’attachement de l’hydrogel, cette technologie à base de micro-chambre facilite la formation de sphéroïdes, même dans les cas de très peu de cellules. Ceci est particulièrement avantageif dans les échantillons limités limités de cellules primaires de type tige de cancer ou d’origine patiente.
La plaque d’imagerie hydrogel micro-chambre permet l’analyse de l’emplacement spatial exact des sphéroïdes au cours d’expériences à long terme pour l’évaluation du processus d’invasion au niveau d’un seul élément et fournit un degré élevé de robustesse statistique et de précision. Les applications futures de cette méthodologie incluent côte à côte la culture multicellulculaire des cellules tumorales et stromal dans différentes régions du macro-puits et la récupération de sphéroïdes individuels pour l’analyse moléculaire en aval.
