Cette recherche a été soutenue par des subventions du National Defense Medical College et par une subvention de recherche en sciences de la santé et du travail pour la recherche sur les maladies insolubles du ministère de la Santé, du Travail et du Bien-être social, au Japon.

Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité de recherche animale du National Defense Medical College (no 16058). Les animaux ont été maintenus sur chow standard de laboratoire (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japon). Les animaux de laboratoire ont été traités conformément aux directives des National Institutes of Health.
1. Collecte et séparation des lymphocytes
REMARQUE : Comme les lymphocytes doivent être frais et ne peuvent pas être stockés, ils doivent être prélevés sur des rats pour chaque expérience. En outre, les lymphocytes intestino-tropiques doivent être prélevés directement dans le conduit thoracique où ils circulent. Toutes les procédures devraient être terminées dans les 6 heures, et tous les instruments, gants et surfaces sont propres. Afin de maintenir les animaux dans un état physiologiquement stable, tous les liquides salins et autres utilisés dans l’expérience doivent être maintenus au chaud.
<ol><li>Former un tube de cannulation (1 mm de diamètre) comme une courbe d’héparine (un rayon d’environ 5 mm) après l’avoir tremper dans de l’eau chaude (environ 80-90 °C) et le fixer à une planche en plastique à l’aide de ruban adhésif pendant quelques heures à l’avance.</li>
	<li>Anesthésier un rat Wistar mâle (8-12 semaines) avec injection intraperitoneal d’un mélange de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg), et Betulphar (2.5mg/kg) et couper les poils du corps de l’abdomen à l’aide d’une tondeuse à cheveux. Retirez fermement les cheveux après le rasage afin que les cheveux n’entrent pas dans la cavité abdominale.</li>
	<li>Après avoir confirmé que la profondeur stable de l’anesthésie requise pour l’intervention est obtenue par pincement des pieds, faire une incision avec des ciseaux chirurgicaux horizontalement de la ligne médiane à la zone subcostale gauche. Veillez à ne pas endommager les vaisseaux sanguins du péritoine pariétal en observant les vaisseaux sous la lumière.</li>
	<li>Enveloppez l’estomac avec de la gaze humide et déplacez doucement l’estomac vers la droite à l’extérieur du corps pour révéler les organes rétroperitoneal. Insérez un cran entre les muscles erector de la colonne vertébrale et le tissu adipeux à l’aide de ciseaux chirurgicaux et séparez-les franchement avec les doigts.</li>
	<li>Dépouillez soigneusement le tissu conjonctif autour du conduit thoracique. L’excès de tissu conjonctif augmente avec l’âge. Exposer le conduit thoracique juste sous les crus gauches du diaphragme caudally jusqu’à ce qu’une longueur de 20 mm du conduit thoracique soit visible. Séparez délicatement les adhérences entre le conduit thoracique et l’aorte à l’aide de pinces de précision ou d’écouvillons de coton mouillés.<ol>
<li>Effectuez ce processus avec soin parce que certains rats ont artérioles ramification de l’artère abdominale traversant sur le conduit thoracique ou un conduit thoracique court en raison d’une position plus élevée du plexus lymphatique (petits conduits thoraciques se propageant comme des toiles d’araignée). Évitez tout contact inutile avec le conduit thoracique pour éviter d’induire un œdème.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Appliquer une ligature par une ficelle (soie 3-0) sur le conduit thoracique juste sous les crus gauches du diaphragme. Le conduit thoracique caudal devient distendu.</li>
	<li>Faire un trou (5 mm de diamètre) dans la paroi abdominale en poignardant le bord de coupe des ciseaux chirurgicaux, passer le tube de cannulation incurvé en épingle à cheveux, et ligate le tube sur le muscle iliopsoas à un moment donné. Remplissez le tube de cannulation avec une solution saline normale contenant 10 U/mL d’héparine.</li>
	<li>Après avoir placé une ficelle (3-0 de soie) sous le conduit thoracique distendu, poignarder le conduit thoracique avec le bord nettement coupé d’un tube de cannulation, le cannuler vers la queue d’environ 5 mm, et ligate le conduit thoracique avec le tube de cannulation pour la fixation.</li>
	<li>Pour fournir de la solution saline pour prévenir la déshydratation, créer un trou (3 mm de diamètre) sur la paroi antérieure de l’antrum de l’estomac à l’aide de pinces de précision et passer le tube de silicium (2 mm de diamètre) au dudénodène à travers l’anneau pylorique. Après avoir brodé une plaie et maintenu les animaux dans les cages de Bollman, commencez à infuser de la solution saline chargée de sucre dans le dudéno de chaque rat à partir du tube de silicium à un débit de 3 mL/h. Couvrir toute la cage d’une serviette en papier pour la garder au chaud.</li>
	<li>Fixer le tube de cannulation au trou au centre du couvercle d’un tube conique de 50 mL sur de la glace contenant 6 U/mL d’héparine, 10 % de sérum bovin fœtal et de milieu RPMI 1640 (pH 7,4; voir le tableau des matériaux) et recueillir les lymphocytes thoraciques des conduits (TDL) sur la glace. Veillez à ne pas entrer en contact entre la pointe du tube et la paroi du tube conique afin d’éviter l’occlusion cannulée due à la formation de caillots fibrins à l’intérieur du tube. Le liquide lymphatique (environ 20 mL) comprenant environ 1,0 x 108~109 lymphocytes peut être obtenu en 6 heures. Pour obtenir les lymphocytes sous anesthésie complète, le plan d’anesthésie est surveillé et le flux lymphatique est observé de manière appropriée. Les mêmes anesthésiques sont ajoutés à la même dose environ 3 heures après que les rats sont mis dans la cage de Ballman pour obtenir une anesthésie profonde en continu pendant 6 heures.</li>
</ol>2. Étiquetage des lymphocytes avec carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFDSE)
<ol><li>Dissoudre le CFDSE(Tableau des matériaux)dans le sulfure de diméthyle (DMSO) à 15,6 mM (500 μg de CFDSE dissous dans 60 μL de DMSO).</li>
	<li>Lymphocytes incubés (1 x 108~109) dans 50 mL de RPMI 1640 avec 50 μL de solution CFDSE pendant 30 min à 37 °C comme décrit précédemment10.</li>
</ol>3. Configuration expérimentale pour des études microvasculaires
<ol><li>Anesthésier les rats receveurs (8 à 12 semaines) par injection intraperitoneal d’un mélange de Midazolam (2 mg/kg), Domitor (0,15 mg/kg) et Betulphar (2,5 mg/kg) et confirmer la profondeur de l’anesthésie par pincement d’orteil. Mouiller l’abdomen avant de toiletter la fourrure pour minimiser la contamination des cheveux. Ensuite, ouvrez l’abdomen du rat Wister receveur par une incision de midline.</li>
	<li>Placez un rat sur une plaque portative en acier inoxydable (environ 120 x 300 mm) avec un trou rectangle autour du centre recouvert d’une glissière en verre (24 x 50 mm). Choisissez environ 10 cm du segment iléal, y compris les PPP pour l’observation.</li>
	<li>Gardez l’intestin aussi chaud que possible et humide avec du phosphate tamponné salin (PBS) réchauffé à 37 °C. Faire tremper la gaze qui est utilisée pour couvrir l’intestin grêle de PBS.</li>
	<li>Tout en donnant une anesthésie continue avec 2 % d’isoflurane (voir tableau des matériaux), mettez la lame sur la scène du microscope et choisissez des zones appropriées pour l’observation de la microcirculation dans les PPP où certains VHS traversent la sérosa. La taille des PPP varie; les plus grands conviennent à l’observation de la microcirculation à l’aide du CLSM. L’intestin grêle n’est pas droit par endroits; un segment droit d’au moins 2 cm de long sans aucune tension convient à l’observation.</li>
	<li>Couvrir le segment intestinal adjacent et la mesenterie de coton absorbant imbibé de PBS. Placez le segment de l’intestin entre deux boules de coton roulées et placez-le aussi loin que possible du corps du rat pour l’empêcher d’être vibré par le battement de cœur et la respiration du rat.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 1 mL, injecter lentement (plus de 1 min) de TDL étiquetés CFSE (1 x 108 cellules) dans la veine jugulaire des rats receveurs. Une injection intraveineuse rapide peut influencer la circulation systémique.</li>
</ol>4. Microcirculation des lymphocytes
<ol><li>Surveillez en permanence les TDL dans la microvasculature des PPP à l’aide de CLSM et enregistrez sur un ordinateur pendant 3 heures en utilisant la photographie en accéléré à intervalles de 30 s. La profondeur de la serosa à l’HEV des PPP est d’environ 25 μm, permettant l’observation des vaisseaux lymphatiques stroma et capillaires à une profondeur de 30 μm.</li>
	<li>Injecter texas red-dextran (25 mg/kg) dans la veine jugulaire de chaque rat receveur pour tacher la circulation sanguine et Hoechest 33342 (5 mg/kg) pour tacher les noyaux cellulaires.</li>
	<li>(Facultatif) Pour quantifier la dynamique des lymphocytes, définissez les lymphocytes adhérant aux VHS plus de 30 secondes comme des « lymphocytes adhésifs » et les lymphocytes qui émigrent des VOV au stroma comme des lymphocytes migrateurs. Calculez ensuite le pourcentage moyen de migration (lymphocytes migrateurs / lymphocytes adhésifs + lymphocytes migrateurs) par champ de vision (environ 0,3 mm2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici nous avons décrit un protocole pour recueillir les lymphocytes intestin-tropiques naïfs et observer leur migration dans des PP de rat. Ces procédures peuvent révéler comment les lymphocytes se déplacent dans la microvasculature des PPP et rendre possible de comparer visuellement leur dynamique dans un état normal ou médicamenteux. L’observation directe de ces dynamiques a beaucoup de mérite pour obtenir un indice de modification immunologique par certains médicaments, bien que la période d’observation ...

Les patchs de Peyer (PPs) se composent de centaines de follicules lymphoïdes dans la propria lamina de l’intestin grêle. Les PPP sont divisés en follicules, la région interfollicular, et les centres germinaux situés dans la partie inférieure des follicules, où les lymphocytes sont stimulés par la présentation d’antigène. Il n’y a pas de vaisseaux lymphatiques afferents, et les antigènes envahissent le propria lamina du lumen intestinal par l’intermédiaire de la couche épithéliale de cellules. La région épithéliale couvrant les follicules lymphoïdes est appelée épithélium associé au follicule, dans lequel les cellules M intercalées spécialisées absorptionnt des antigènes muqueux. Les lymphocytes M prennent des antigènes du côté luminal et les antigènes sont ensuite capturés par des cellules dendritiques et présentés vers des lymphocytes naïfs qui s’écoulent dans les PPP par l’endothelium des venules endothéliales élevées (HEVs)1. Les PPP jouent un rôle important dans l’immunité intestinale et sont liés au stade précoce de l’inflammation. Beaucoup d’interactions moléculaires impliquent l’entrée des lymphocytes aux organes lymphoïdes secondaires (SLOs), y compris des molécules d’adhérence, des chemokines2,3,et la sphingosine-1-phosphate4; ainsi, il y a beaucoup de cibles thérapeutiques prévues. Par conséquent, l’observation de la dynamique des lymphocytes dans les PPP nous permet d’apercevoir le stade très précoce de l’inflammation et d’examiner l’utilité de plusieurs médicaments prometteurs.
La méthode se concentre ici sur la migration des lymphocytes dans les PPP, qui comprend plusieurs procédures (cannulation dans le conduit thoracique5 et la collecte des lymphocytes et l’observation à long terme après l’injection dans les lymphocytes collectés). Étant donné que ces procédures sont complexes et qu’il était difficile de voir exactement comment chaque procédure a été effectuée dans des rapports précédents, nous avons mentionné ici quelques conseils pour parvenir à une observation réussie. Par exemple, la cannulation des tubes dans le conduit thoracique était très difficile, et le taux de succès initial de la cannulation était inférieur à 50%. Cependant, nous avons amélioré la méthode et obtenu un taux de réussite supérieur à 80%. Nous avons mentionné quelques autres bouts dans ce manuscrit qui sont nécessaires pour l’observation réussie pour permettre l’évaluation quantitative de la migration transendothelial des lymphocytes dans plusieurs conditions.
Dans les rapports précédents, il était difficile de comprendre les changements tridimensionnels au fil du temps, tels que l’injection intraveineuse de l’encre de Chine pour tacher la structure vasculaire desPPP 6, ou le microscope étant monofocal7. Ces dernières années, une méthode d’observation utilisant certains animaux transgéniques de protéine de fluorescence photoconvertible tels que les souris de Kaede ont clarifié les mouvements cellulaires systématiques in vivo8. L’autre étude a clarifié l’arrêt indépendant cd69 de l’évacuation des lymphocytes desPPP 9. Nous avons utilisé la microscopie à balayage laser confoccal (CLSM) en raison de sa capacité d’analyse élevée. Maintenant, nous pouvons facilement obtenir des images à haute résolution et les utiliser pour analyser la dynamique des lymphocytes.
Dans ce rapport, nous avons démontré une série de méthodes pour évaluer la migration de lymphocyte dans les PPP. Tout d’abord, nous avons montré des méthodes raffinées de cannulation thoracique des conduits pour recueillir les lymphocytes. Deuxièmement, nous avons amélioré les méthodes d’observation de plusieurs façons pour maintenir les organes objectifs dans la mesure du possible sous observation microscopique, ce qui nous a permis d’obtenir des images de haute qualité pendant 3 heures. Troisièmement, nous avons quantifié les mouvements cellulaires de la migration des lymphocytes pour évaluer les effets de certains médicaments. Ces protocoles modifiés contribueront au développement d’évaluations d’immunologie muqueuse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:913px;" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">A1R+</td>
			<td style="width:213px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:265px;">Comfocal Laser Scanning Microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechest 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Texas Red&#8211;dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

Les lymphocytes naïfs recirculent du sang aux tissus lymphoïdes dans un état physiologique et il est généralement reconnu comme un phénomène important dans l’immunité intestinale. Le stroma des organes lymphoïdes secondaires, tels que les patchs de Peyer (PPs) ou les ganglions lymphatiques mésentériques, sont l’endroit où les lymphocytes naïfs détectent les antigènes. Les lymphocytes naïfs circulent dans le sang pour atteindre les venules endothéliales élevées, le portail d’entrée dans les PPP. On estime que certains immunomodulateurs influencent la migration des lymphocytes, mais l’évaluation précise de la dynamique de microcirculation est très difficile, et l’établissement d’une méthode pour observer la migration des lymphocytes in vivo peut contribuer à la clarification des mécanismes précis. Nous avons affiné la méthode de collecte des lymphocytes du conduit lymphatique et d’observation de la dynamique détaillée des lymphocytes intestino-tropiques chez les rats. Nous avons choisi la microscopie confoccale de balayage de laser pour observer des PP de rat in vivo et l’avons enregistrée utilisant la photographie de time-lapse. Nous pouvons maintenant obtenir des images claires qui peuvent contribuer à l’analyse de la dynamique des lymphocytes.

Collecte des lymphocytes de la lymphe Pour préparer le rat à la cannulation thoracique du conduit, faites une incision dans le conduit thoracique tendu, comme le montre la figure 1, puis maintenez le rat dans la cage d’un Bollman, comme le montre la figure 2.
Lorsque les lymphocytes sont bien collectés, nous pouvons obtenir environ 20 mL/6 h de liquide lymphatique contenant environ 10lymphocytes 7~1...

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Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Ici, nous décrivons une méthode précise pour recueillir les lymphocytes thoraciques de conduit et observer la migration des lymphocytes intestin-tropiques dans les corrections de Rat Peyer pendant 3 heures utilisant la photographie de time-lapse. Cette technique peut clarifier comment la dynamique des lymphocytes sont affectés dans des conditions inflammatoires.

Observation microscopique de la dynamique des lymphocytes dans les patchs de Rat Peyer

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

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3.9K vues.  National Defense Medical College. Ici, nous décrivons une méthode précise pour recueillir les lymphocytes thoraciques de conduit et observer la migration des lymphocytes intestin-tropiques dans les corrections de Rat Peyer pendant 3 heures utilisant la photographie de time-lapse. Cette technique peut clarifier comment la dynamique des lymphocytes sont affectés dans des conditions inflammatoires.

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Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Recherche

Médecine

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss of relevant amounts of heart muscle mass can lead to the heart failure. Besides heart transplantation, there is no curative treatment option for the end-stage heart failure. In times of organ donor shortage, organ independent treatment modalities are needed. Left-ventricular assist devices are a promising therapy option, however, especially as destination therapy, limited by its side-effects like stroke, infections and bleedings. In recent years, several cardiac repair strategies including stem cell injection, cardiac progenitors or myocardial tissue engineering have been investigated. Recent improvements in cell biology allow for the differentiation of large amounts of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). One of the cardiac repair strategies currently under evaluation is to transplant artificial heart tissue. Engineered heart tissue (EHT) is a three-dimensional in vitro created cardiomyocyte network, with functional properties of native heart tissue. We have created EHT-patches from hiPSC derived cardiomyocytes. Here we present a protocol for the induction of left ventricular myocardial cryoinjury in a guinea pig, followed by implantation of hiPSC derived EHT on the left ventricular wall.

Here we present a protocol for the induction of left ventricular cryoinjury followed by the implantation of a cardiac muscle patch, derived from human iPS-cell cardiomyocytes in a guinea pig model.

Implantation des dérivés hiPSC myocarde patchs après lésion myocardique dans un modèle de cochon d’Inde

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Une blessure de ballon segmental contrôlé par pression d’artère de rat carotide avec l’application thérapeutique periadventitial

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is currently the only treatment for life-threatening ventricular fibrillation. However, defibrillation may have side-effects, including intolerable pain, tissue damage, and worsening of prognosis, indicating a significant medical need for the development of more gentle cardiac rhythm management strategies. Besides energy-reducing electrical approaches, cardiac optogenetics was introduced as a powerful tool to influence cardiac activity using light-sensitive membrane ion channels and light pulses. In the present study, a robust and valid method for successful photostimulation of Langendorff perfused intact murine hearts will be described based on multi-site pacing applying a 3 x 3 array of micro light-emitting diodes (micro-LED). Simultaneous optical mapping of epicardial membrane voltage waves allows the investigation of the effects of region-specific stimulation and evaluates the newly induced cardiac activity directly on-site. The obtained results show that the efficacy of defibrillation is strongly dependent on the parameters chosen for photostimulation during a cardiac arrhythmia. It will be demonstrated that the illuminated area of the heart plays a crucial role for termination success as well as how the targeted control of cardiac activity during illumination for modifying arrhythmia patterns can be achieved. In summary, this technique provides a possibility to optimize the on-site mechanism manipulation on the way to real-time feedback control of cardiac rhythm and, regarding the region specificity, new approaches in reducing the potential harm to the cardiac system compared to the usage of non-specific electrical shock applications.

This work reports a method for controlling the cardiac rhythm of intact murine hearts of transgenic channelrhodopsin-2 (ChR2) mice using local photostimulation with a micro-LED array and simultaneous optical mapping of epicardial membrane potential.

Gestion avancée du rythme cardiaque par application d’une photostimulation optogénétique multisite dans les cœurs murins

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

The Microscopic Transcanal Approach in Stapes Surgery Revisited

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the external auditory canal, the middle ear, and epitympanon. Such an approach avoids a retroauricular or endaural skin incision; however, working through a narrow space needs angled microsurgical instruments and specific training in otologic surgery. The transcanal approach restricts the working space; however, it offers a binocular microscopic vision into the middle ear without extended skin incisions and thus, reducing post-operative pain and bleeding. In addition, this minimally invasive approach avoids scar tissue complications, hypoesthesia of the auricle, and potential protrusion of the pinna. Despite its numerous advantages, this method is still not routinely performed by otologic surgeons. Since this minimally invasive technique is more challenging, there is a need for extensive training in order for it to be widely adopted by otologic surgeons. This article provides step-by-step surgical instructions for stapes surgery and reports possible indications, pitfalls, and limitations using this microscopic transcanal technique.

This article describes the microscopic transcanal technique for stapes surgery, providing step-by-step surgical instructions for familiarizing surgeons with this approach.

L’approche transcanalaire microscopique en chirurgie strieuse revisitée

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the ...

Microscopic Replantation of Penile Glans Amputation Due to Circumcision

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans amputation, which is a very rare iatrogenic genital injury. Such complication is conventionally treated by simple hemostasis to achieve self-healing, early gross replantation, or delayed plastic surgery. However, these may lead to obvious unfavorable outcomes such as amputated glans loss, necrosis, malformation healing, or urethral orifice stenosis. In the present study, we adopted microscopic replantation as an emergency approach to achieve the precise anastomoses and anatomic reconstruction of penile glans. The goal of this protocol is to present a detailed emergency management strategy with meticulous surgical skills for the penile glans amputation. The postoperative results showed that the original shape of the glans was perfectly restored with satisfactory cosmetic appearance. The micturition function was completely restored to normal without any obvious complications. There was also no significant reduction in the sensation of amputated glans area. Hence, early meticulous microscopic replantation as soon as possible is an ideal emergency management strategy for the penile glans amputation due to circumcision.

The present protocol describes the emergency management of microscopic replantation of penile glans amputation due to circumcision.

Replantation microscopique de l’amputation du gland pénien due à la circoncision

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans ...

Microscopic Cyst Resection for the Treatment of Patients Diagnosed with Epididymal Cyst

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative asoedema, hematoma, sustaining pain, and seminal tract obstruction in patients who have undertaken nonmicroscopic epididymal cyst resection or epididymal resection. Nonmicroscopic epididymal cyst surgery is suggested for patients with childbirth plans as a precaution. The treatment of male epididymal cysts via microtechnology is obviously a beneficial option; we took the lead in carrying out microscopic epididymal exploration and cyst resection surgery in China. From September 2017 to April 2021, 41 young and middle-aged male patients diagnosed with epididymal cysts underwent microtechnology treatment in a program titled &#34;microscopic epididymal exploration and cystectomy&#34;. The postoperative follow-up lasted for 3-50 months. The results confirmed that, as microscopic manipulation largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis, the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact under the microscope. Bleeding during the operation was significantly reduced (2-3 mL) and wound drainage was not required. According to follow-up data, microscopic treatment significantly reduced the incidence of postoperative scrotal hematoma, edema, and long-term postoperative pain, thereby promising a higher surgical success rate as well as recurrence prevention. Besides, preliminary experience and reflection suggest that microscopic epididymal exploration and cystectomy provide efficient preservation of the epididymal patency through refined treatment, while a better prognosis can be achieved. We recommend that surgery be carried out before the epididymal cyst develops to 0.8 cm in diameter, for fear that a larger epididymal cyst (&#62;0.9 cm in diameter) could cause the complete destruction of all tubules of the ipsilateral epididymis - a more severe case with damage to the testicular output network.

Here, we present a protocol to treat patients diagnosed with an epididymal cyst using microscopic cyst resection. Based on microscopic manipulation, a largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis was obtained, so the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact.

Résection microscopique de kystes pour le traitement des patients diagnostiqués avec un kyste épididymaire

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative ...

Microscopic Electric Rotary Grinding of Plaques Combined with Graft Repair in the Management of Peyronie's Disease

Peyronie's Disease (PD) is clinically characterized by the development of localized fibrous plaques, primarily on the tunica albuginea, especially on the dorsal area of the penis. These plaques are the hallmark feature of this condition, resulting in penile curvature, deformity, and painful erections for affected individuals. Although various nonsurgical treatment options exist, their overall effectiveness is limited. As a result, surgical intervention has become the ultimate choice for patients with severe penile curvature deformities and associated erectile dysfunction. Our research team has successfully employed a combined approach involving microscopic electric rotary grinding of the fibrous plaques and the use of tunica vaginalis or bovine pericardium as graft materials for the repairing of the defects of tunica albuginea in the treatment of PD. This approach has consistently yielded highly satisfactory results regarding the restoration of penile shape, with excellent cosmetic results and significantly improved sexual satisfaction. 
This protocol aims to present a comprehensive surgical management strategy utilizing electric rotary grinding of the plaques and repairing the defects of tunica albuginea by using the tunica vaginalis, which represents an optimal surgical strategy for treating PD.

The presented protocol describes a microscopic surgical method for the treatment of Peyronie's disease by using electric rotary grinding of the plaques followed by using the tunica vaginalis or bovine pericardium as a graft for the repairing of the defects of the tunica albuginea.

Broyage rotatif électrique microscopique de plaques combiné à la réparation de greffes dans la prise en charge de la maladie de La Peyronie

Peyronie's Disease (PD) is clinically characterized by the development of localized fibrous plaques, primarily on the tunica albuginea, especially on the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocole pour l’étude de la dynamique gastro-intestinale et des effets des médicaments sur la motilité

Using An In Vitro Tissue Perfusion System to Detect the Functional Activities of Isolated Intestinal Tubes in Real Time

Gastrointestinal diseases, which have a high incidence, pose considerable challenges for humans. The small intestine is integral to food and drug digestion and absorption and plays a crucial role in treating these diseases. The intestinal tube movement experiment, a common and essential in vitro method, is utilized to study gastrointestinal dynamics. This includes the preparation of the isolated intestinal tube, as well as the suspension of the prepared intestinal tube in the bath and its connection to a signal detector. This is followed by the recording and analysis of a series of parameters, such as tension, which can be used to assess intestinal motor function, as well as considerations for keeping the intestinal tube active in vitro. The standardized program from sampling to data collection greatly improves the repeatability of the experimental data and ensures the authenticity of the recording of intestinal tension after physiological, pathological, and drug intervention. Here we present the key problems in experimental operation and a valuable reference experimental protocol for studying drugs that regulate gastrointestinal motility.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Évaluation in vitro fiable et reproductible de l’impact des médicaments sur les tubes intestinaux de rat

We present a method for isolating rat intestinal tubes and assessing the impact of drugs on their tension, frequency, and amplitude in vitro. This method offers a valuable approach for researchers investigating intestinal tubes.