Photoconversion fournit une méthode in vivo trackable pour l’analyse quantitative de l’évacuation des leucocytes pour un aperçu mécaniste de la résidence des leucocytes et de la dynamique de sortie de plusieurs sites tissulaires dans les états maladie. Eh bien, ici nous démontrons l’utilité du suivi des leucocytes à partir de tumeurs cutanées. L’application de cet essai à d’autres tissus et maladies est limitée seulement par la capacité d’administrer la lumière.
Le principal avantage de cette technique est que pour permet la quantification des populations endogènes, plutôt que transférées cellules immunitaires comme une issue des tissus enflammés in vivo. Pour induire une inflammation, après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils, utilisez une micropipette pour administrer 20 microlitres de phtalate de dibutyle ou DBP, du côté ventral de la pinna de l’oreille d’une souris transgénique Kaede anesthésiée. Après avoir laissé sécher le DBP, tirez l’oreille à travers une fente dans un morceau de papier d’aluminium et utilisez du ruban adhésif à double face pour fixer l’oreille à plat sur le papier d’aluminium avec le côté dorsale orienté vers le haut.
Ensuite, position que vous êtes directement sous une source de lumière de 405 nanomètres et photoconvertir pendant trois minutes à 100 milliwatts de puissance. Pour l’infection par la vaccinia, utilisez une micropipette pour administrer 5 fois 10 à la 6ème plaque formant des unités de vaccinia dans 10 microlitres de PBS sur la pinna d’oreille d’une souris transgénique kaede anesthésiée et piquer la pinna 25 fois. 24 heures plus tard, photoconvertir la pinna comme vient de le démontrer.
Au moment expérimental approprié, récolter les pignons et les ganglions lymphatiques cervicaux et inguinaux et utiliser deux paires de pinces à épiler le côté ventral et dorsale de chaque pinna. Placez ensuite les ganglions lymphatiques et les morceaux de pinna, avec l’intérieur de l’oreille face vers le bas, dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits contenant 1 milligramme par millilitre de Collagène D et 80 unités par millilitre d’ADN dilué dans HBSS contenant du calcium et du magnésium. Utilisez deux aiguilles de calibre 29 pour taquiner chaque capsule de ganglion lymphatique et placer la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
À la fin de l’incubation, presser les tissus digérés de pinna et de ganglion lymphatique à travers des passoires cellulaires en nylon séparées de 70 Microns pour obtenir des suspensions cellulaires simples de chaque tissu. Quand les tumeurs se sont développées à la taille expérimentale appropriée, rasez n’importe quelle fourrure nouvellement repousse autour du site de tumeur et tirez la tumeur par un trou circulaire coupé dans un morceau de papier d’aluminium. Placez la tumeur directement au-dessous de la source lumineuse de 405 nanomètres et photoconvertiez pendant 5 minutes à 200 milliwatts de puissance.
24 heures après la photoconversion, récolter les tumeurs et les ganglions lymphatiques brachiaux et inguinaux de chaque animal et utiliser des ciseaux pour émincer les tumeurs dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits contenant collagène D et DNase dans HBSS. Placez les ganglions lymphatiques dans des puits séparés et taquinez les capsules comme nous venons de le démontrer. Après avoir incubé les tumeurs pendant une heure et les ganglions lymphatiques pendant une demi-heure à 37 degrés Celsius, pressez les tissus digérés à travers des passoires distinctes de 70 Microns pour obtenir des suspensions cellulaires simples de chaque tissu.
Pour analyser les suspensions à cellule unique par cytométrie d’écoulement, recueillir d’abord la rate ou le sang d’une souris transgénique Kaede et lyse les globules rouges avec tampon de potassium chlorure d’ammonium. Divisez les cellules en une seule Kaede FITC non convertie et une population kaede PE convertie et resuspendez les cellules Kaede PE d’une seule couleur en un millilitre de PBS dans un puits d’une plaque de 24 puits, puis photoconvertiez les cellules pendant 5 minutes sous une source lumineuse de 405 nanomètres à 100 milliwatts de puissance. Ensuite, utilisez les cellules Kaede PE photoconverties et les cellules Kaede FITC non converties pour régler les tensions photomultiplier à 70 à 80% de la portée totale de chaque canal fluorescent.
Une fois que les tensions pour les protéines Kaede ont été réglées, compenser toutes les autres taches primaires d’anticorps à l’aide de perles de compensation étiquetées fluorophore unique, selon les instructions du fabricant. Ensuite, exécutez les échantillons sur le cytomètre d’écoulement selon les protocoles standard d’analyse cytométrique de flux. Les suspensions à cellules simples générées par la peau de l’oreille ou les ganglions lymphatiques drainants cervicaux immédiatement après l’exposition à la photoconversion révèlent une efficacité de conversion de 78 % de tous les leucocytes positifs CD45 dans la peau, sans cellules converties observées dans les ganglions lymphatiques drainants.
La quantification du nombre de leucocytes positifs CD45 infiltrants dans les oreilles photo converties zéro et 24 heures après la conversion, révèle que l’exposition à la lumière violette provoque une augmentation statistiquement significative de l’infiltration des leucocytes. Cette augmentation de l’infiltration positive de leucocyte CD45 cependant, est petite par rapport à l’infiltration induite par un stimulus inflammatoire puissant tel que le virus de vaccinia. La photoconversion augmente également la perméabilité vasculaire dans les pinnae d’oreille telles que mesurées par l’analyse de Miles, tout en indiquant que les effets de la lumière violette sur l’inflammation des tissus devraient être pris en compte lors de l’optimisation de la dose, du temps d’exposition et de l’interprétation des données.
L’analyse cytométrique de flux des cellules tumorales dissociées des animaux photoconvertis révèle une conversion significative des cellules positives intratumorales de CD45 de Kaede FITC positives à Kaede PE positives, tandis que les cellules drainantes de ganglion lymphatique restent non converties. L’efficacité de photoconversion des leucocytes positifs de CD45 a varié de manière significative entre les types et les tailles de tumeur, avec des leucocytes positifs de CD45 dans de petites tumeurs de mélanome démontrant la photoconversion la plus efficace. Comme les volumes tumoraux augmentent, l’efficacité de conversion diminue à environ 50%Notamment, la mélanine a un impact frappant sur l’efficacité de la photoconversion avec une photoconversion maximale des cellules positives CD45 observées dans les tumeurs productrices de mélanine de seulement environ 30% dans les tumeurs plus petites, qui tombe à 10% que les volumes tumoraux approchent de 400 millimètres cubes.
L’examen des ganglions lymphatiques drainants de tumeur 24 heures après photoconversion indique la présence des cellules immunitaires positives rouges de Kaede de divers phénotypes, démontrant ainsi l’émigration de leucocyte de la tumeur photoconverted. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour découvrir la cinétique de l’état stable et le chiffre d’affaires enflammé de leucocyte dans le tissu périphérique. Tout en essayant cette procédure, il est important de s’assurer que seul le tissu d’intérêt est photoconverti, car la photoconversion accidentelle du tissu environnant compromettra vos résultats.
Les personnes nouvelles à cette méthode devraient optimiser le temps d’exposition pour la conversion de leurs tissus, ainsi que la durée des temps avant la collecte des tissus se produit en fonction de la dynamique du leucocyte d’intérêt.
