Les auteurs tiennent à remercier Michael Solga et le reste du personnel de base de cytométrie en flux pour avoir fourni une formation et des services en cytométrie en flux. Les auteurs aimeraient également remercier Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye et Prasad Srikakulapu pour leur aide à la préparation des liposomes (SSKD, DKB), aux prélèvements de tissus (MAM, JCG), à la coloration par cytométrie en flux et à l’acquisition d’échantillons (AU, PS, CM). Ce travail a été soutenu par des subventions AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 et R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 et T32 HL007284.

<ol>
	<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+from+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 286 (2015).</li><li>Osinski, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liposomal+delivery+of+PPAR&#945;/&#947;+dual+agonist+tesaglitazar+in+a+model+of+obesity+enriches+macrophage+targeting+and+limits+liver+and+kidney+drug+effects.">In vivo liposomal delivery of PPAR&#945;/&#947; dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects.</a> Theranostics. 10 (2), (2020).</li><li>Bauknight, D. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Use+of+Tail+Vein+Metastasis+Assays+and+Real-Time+In+Vivo+Imaging+to+Quantify+Breast+Cancer+Metastatic+Colonization+and+Burden+in+the+Lungs.">Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2019).</li><li>Dasa, S. S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plectin-targeted+liposomes+enhance+the+therapeutic+efficacy+of+a+PARP+inhibitor+in+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer.</a> Theranostics. , (2018).</li><li>Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-mediated+recruitment+of+NK+cells+is+a+critical+host+defense+mechanism+in+invasive+aspergillosis.">Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2003).</li><li>Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jir&#243;n Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestion+of+the+murine+liver+for+a+flow+cytometric+analysis+of+lymphatic+endothelial+cells.">Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e58621 (2019).</li><li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis.">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation research. , (2019).</li><li>O'Brien, C. A., Harris, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain.">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici un protocole en trois parties pour (i) préparer des liposomes marqués avec un colorant lipidique fluorescent et chargés d’un composé antidiabétique, le tesaglitazar, (ii) administrer des liposomes à une souris par injection rétro-orbitale, et (iii) récolter, traiter et colorer les tissus pour détecter l’absorption des liposomes au niveau cellulaire par cytométrie en flux. Ce protocole examine la préparation de liposomes d’environ 150 μm et l’évaluation de l’absorption dans le tissu adipeux, le sang et la rate. La préparation des liposomes est évolutive, réalisée principalement à température ambiante et utilise l’évaporation en phase inverse pour maximiser la charge médicamenteuse et l’élimination des solvants organiques. En utilisant ce protocole, une concentration de tésaglitazar allant jusqu’à 2 mg/mL peut être atteinte dans l’échantillon de liposomes purifiés. Les liposomes préparés peuvent être conservés dans un tampon HEPES à 4 °C pendant plus d’un an. D’après notre expérience, ils ont démontré une variation minimale de la taille moyenne des particules. Moins de 10% de la perte de contenu du médicament a été démontrée par spectrophotométrique, après séparation par ultrafiltration des liposomes du médicament externe avec un filtre centrifuge de 10 kDa.
Lors de la préparation des liposomes, il y a quelques étapes et facteurs critiques à considérer. Tout d’abord, l’ordre des étapes du protocole est important et doit être respecté. Deuxièmement, le pH de la solution utilisée lors du chargement du tésaglitazar doit être maintenu à 7,4 afin de maximiser la solubilité et la charge efficace. Troisièmement, l’assemblage approprié de l’équipement et des filtres garantit que le rendement de chaque étape est de la taille et de la pureté appropriées. Par exemple, si les filtres de 100 et 200 nm ne sont pas assemblés correctement, un lot de liposomes plus hétérogène et mal dimensionné peut en résulter. Quatrièmement, l’élimination complète de l’acétate de Ca-acétate avant la charge médicamenteuse est nécessaire pour maximiser le transfert du tésaglitazar dans les liposomes. Pour tester l’élimination complète de l’acétate de Ca, utilisez la sédimentation à grande vitesse pour éliminer les liposomes, puis mesurez les niveaux d’acétate de Ca-dans la solution non liposomale. Cinquièmement, il est important de peser et d’enregistrer la masse de tous les matériaux ajoutés à la préparation des liposomes à chaque étape. Cela garantit que les concentrations appropriées peuvent être calculées et que les ratios de matériaux nécessaires sont maintenus. Enfin, si la technique n’est pas correctement exécutée, il peut y avoir un niveau indésirable d’hétérogénéité. Il est important de vérifier soigneusement ce paramètre à l’aide de DLS et d’autres approches telles que la microscopie électronique. Pour améliorer l’homogénéité, envisagez d’ajuster la taille du filtre sélectionné ou d’empiler deux filtres.
De plus, il est essentiel que les témoins et un panel d’anticorps pour la cytométrie en flux soient planifiés et optimisés avant d’exécuter ce protocole dans son intégralité (Tableau 1, Tableau 3). Les anticorps doivent être testés pour s’assurer que les concentrations appropriées sont utilisées pour la coloration et que le chevauchement entre les fluorophores est minime. L’excitation et l’émission du colorant utilisé lors de la préparation des liposomes doivent également être prises en compte dans la planification du panel. Dans nos résultats, nous avons utilisé DiD, qui a une excitation et une émission similaires aux fluorophores tels que l’allophycocyanine (APC) et l’AlexaFluor 647. Ainsi, nous n’avons pas sélectionné d’anticorps conjugués à ces fluorophores dans notre panel d’anticorps. De plus, les contrôles d’isotypes ne sont pas inclus dans ce protocole. En effet, les anticorps sélectionnés pour ce protocole sont des anticorps bien validés et disponibles dans le commerce. Cependant, si vous souhaitez utiliser un anticorps qui n’a pas été optimisé auparavant, veuillez envisager de tester l’anticorps contre un témoin d’isotype sur les tissus d’intérêt avant de mener l’expérience complète.
Bien que ce protocole démontre comment extraire et traiter le sang, la rate, le tissu adipeux inguinal et les tissus adipeux épididymaires de la souris après le traitement, cette approche générale peut être appliquée à d’autres tissus. Selon le tissu d’intérêt, les protocoles de traitement et de digestion peuvent devoir être modifiés comme cela est publié pour les tissus suivants: poumon21, foie 22, cavité péritonéale 3, moelle osseuse3,23, cerveau 24.
Une limite importante de cette méthode à considérer est que l’absorption ne peut être évaluée qu’à un seul moment par animal. Ainsi, il peut être avantageux de coupler ce protocole avec d’autres techniques d’imagerie non invasives ou de planifier en conséquence pour assurer des ressources suffisantes pour effectuer l’évaluation. Le moment de l’absorption cellulaire et le renouvellement cellulaire sont des facteurs importants à prendre en compte : les liposomes circuleront dans tout le corps au cours des premières 24 heures et, en fonction de la durée de vie des cellules qui absorbent les liposomes ou de la façon dont elles réagissent à l’absorption, la mort cellulaire ou une phagocytose supplémentaire peut survenir. Notre étude précédente a démontré des changements dans les caractéristiques de la population des populations DiD+ à différents moments3. Pour cette raison, il est important d’évaluer l’adoption à des moments antérieurs ou aux points temporels les plus pertinents pour la biologie du mécanisme d’intérêt. De plus, alors que la quantification de l’absorption cellulaire dans l’ensemble du tissu peut être effectuée avec ce protocole, la cytométrie en flux ne peut pas révéler la localisation tissulaire. Le couplage de cette approche avec des méthodes histologiques peut aider à remédier à cette limitation.
En général, ce protocole complète les méthodologies existantes telles que l’histologie et l’imagerie par fluorescence du corps entier. Avec les progrès continus des outils et des méthodes de cytométrie en flux, le développement de panels plus grands pour des populations cellulaires de plus en plus spécifiques deviendra possible. Nous suggérons que ce protocole soit utilisé en plus des méthodes susmentionnées, car cela améliorera l’évaluation de l’absorption cellulaire et fournira également la possibilité de valider les résultats observés par cytométrie en flux. Par exemple, faut-il constater que la majorité des particules dans le tissu adipeux ont été absorbées par les macrophages par cytométrie en flux. L’immunofluorescence d’une partie aliquote supplémentaire du même tissu adipeux pourrait être sauvegardée, fixée, sectionnée et colorée pour les marqueurs de macrophages afin de vérifier que le type de cellule absorbe bien les liposomes. Cette approche devrait ajouter de la rigueur aux essais de biodistribution des nanoparticules menés : validation du ciblage spécifique des cellules, quantification de l’absorption cellulaire, identification de l’absorption hors cible et, espérons-le, fourniture d’informations pour générer des hypothèses mécanistes pour les résultats thérapeutiques observés. Ce protocole peut également être adapté pour de futures études utilisant différents liposomes, étudiant l’absorption dans d’autres tissus et testant de nouveaux composés dans le contexte de l’obésité et du dysmétabolisme ou de toute autre maladie dans laquelle l’administration de nanoparticules est une option thérapeutique réalisable.

À mesure que l’intérêt pour le développement de thérapies utilisant l’administration de médicaments par nanoparticules augmente, les méthodes de préparation et d’évaluation de la distribution et de l’absorption des particules doivent continuer à progresser, à se développer et à être accessibles au milieu de la recherche 1,2. Ce protocole a été développé pour évaluer les types de cellules exactes qui ont absorbé les liposomes in vivo après un traitement avec des liposomes marqués DiD chargés de tésaglitazar, unagoniste 3,4 du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR)-α/γ. Dans ces études, nous avons pu évaluer quels types de cellules étaient directement touchés par le traitement par tésaglitazar liposomal, l’efficacité du ciblage des fractions et générer des hypothèses pour expliquer les résultats du traitement que nous avons observés. De plus, les fonctions biologiques établies dans une variété de types cellulaires suggèrent que les cellules phagocytaires telles que les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules de Kupffer spécifiques au foie absorbent la plupart des liposomes 5,6,7. En utilisant ce protocole, nous avons démontré que les phagocytes non classiques pouvaient également absorber les liposomes 3,4.
Ce protocole présente une méthode optimisée pour solubiliser le tesaglitazar, préparer les liposomes par évaporation en phase inverse et utiliser l’acétate de calcium comme attractif pour la charge de médicaments à distance. Les méthodes présentées sont accessibles à de nombreux laboratoires et manquent de matériaux difficiles à acquérir et d’étapes nécessitant des températures élevées. Le protocole produit des liposomes de tailles optimales pour une circulation accrue in vivo8. En outre, comme l’ont résumé Su et coll., à ce jour, des méthodes d’évaluation de la distribution in vivo des liposomes et de l’absorption tissulaire ont été étudiées et testées en profondeur9. Les méthodes de tomographie par émission de positons (TEP), d’imagerie par résonance magnétique (IRM) et de tomographie moléculaire par fluorescence (FMT) sont appliquées pour quantifier la biodistribution et l’absorption spécifiques aux tissus 9,10,11. Bien que ces méthodes aient été optimisées pour maximiser la détection in vivo, elles n’ont toujours pas la capacité de quantifier l’absorption des liposomes in vivo à la résolution cellulaire. Le protocole présenté ici vise à répondre à ce besoin grâce à l’utilisation de la cytométrie en flux. Enfin, pour ce protocole, l’absorption cellulaire a été réduite à quelques tissus, y compris le tissu adipeux. Il existe de plus en plus de littérature sur le potentiel d’utilisation des nanoparticules pour administrer des thérapies dans le contexte de l’obésité, du dysmétabolisme et de l’inflammation 12,13,14,15,16,17. À ce titre, nous avons jugé important de partager un protocole avec des méthodes efficaces de traitement et d’analyse du tissu adipeux, l’un des tissus qui joue un rôle important dans ces pathologies.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103251</td>
			<td>Clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-1152-82</td>
			<td>Clone AFS98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0114-82</td>
			<td>Clone N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD19 PE CF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562291</td>
			<td>Clone 1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3 FITC antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553061</td>
			<td>Clone 145-2C11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31 BV605</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102427</td>
			<td>Clone 390</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PerCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557235</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>700-107P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting spin-column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89889, 89890</td>
			<td>Zeba spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering, Nicomp 370</td>
			<td>Particle Sizing System, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIX &#38; PERM Cell Permeabilization Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>GAS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Dermacea</td>
			<td>441211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3393-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome extruder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z373400</td>
			<td>LiposoFast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Aqua</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic lubricant</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td></td>
			<td>20g/70 oz Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>433689L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene vial for mincing</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>Re111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Misonix</td>
			<td>XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T/Pump Heat therapy pump and pad</td>
			<td>Gaymer Industries</td>
			<td>TP-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tesaglitazar</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Track-etched polycarbonate membranes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1141Z**</td>
			<td>Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer/DLS-ELS system</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes

Il existe un intérêt croissant pour l’utilisation des liposomes pour délivrer des composés in vivo, en particulier pour les approches de traitement ciblées. Selon la formulation des liposomes, les liposomes peuvent être absorbés préférentiellement par différents types de cellules dans le corps. Cela peut influencer l’efficacité de la particule thérapeutique car la progression de différentes maladies est spécifique au tissu et au type cellulaire. Dans ce protocole, nous présentons une méthode de synthèse et de marquage fluorescent des liposomes à l’aide de DSPC, de cholestérol et de PEG-2000 DSPE et du colorant lipidique DiD en tant que marqueur fluorescent. Ce protocole présente également une approche pour administrer des liposomes in vivo et évaluer l’absorption spécifique des liposomes par cytométrie en flux. Cette approche peut être utilisée pour déterminer les types de cellules qui absorbent les liposomes et quantifier la distribution et la proportion de l’absorption des liposomes entre les types de cellules et les tissus. Bien que cela ne soit pas mentionné dans ce protocole, des tests supplémentaires tels que l’immunofluorescence et l’imagerie par fluorescence unicellulaire sur un cytomètre renforceront les résultats ou les conclusions formulés car ils permettent d’évaluer la coloration intracellulaire. Les protocoles peuvent également devoir être adaptés en fonction du ou des tissus d’intérêt.

Production de liposomes
Les résultats publiés ici sont similaires à ceux de nos travaux précédemment publiés 3,4,20. En utilisant le protocole présenté ici, nous prévoyons de produire des liposomes d’une taille d’environ 150 à 150 nm. Le DLS révèle un diamètre moyen de liposomes de 163,2 nm et un potentiel zêta de -19,2 mV (Figure 1A). L’imagerie par microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) révèle des liposomes circulaires (Figure 1B) et le diagramme DLS révèle un écart type relativement faible par rapport au diamètre moyen (Figure 1C).
La liaison positive aux liposomes nécessite un contrôle traité par PBS
Des études antérieures de notre groupe utilisant ce protocole ont examiné quels sous-ensembles cellulaires dans la SVF adipeuse, la rate et le sang liés aux liposomes après une semaine d’administration in vivo 3,4. À l’aide d’une souris traitée au PBS, les cellules de la cavité péritonéale et de la rate ont été colorées avec le même panel d’anticorps utilisé sur des échantillons de souris traitées par liposomes. Les tissus ont été prélevés après une semaine de traitement (figure 2A). Les échantillons de la souris traitée au PBS ont servi de FMO DiD avec lequel créer des portes DiD positives (Figure 2B,C). Une porte positive peut être créée à l’aide d’un signal DiD-positif, mais les échantillons dépourvus de signal DiD doivent également être utilisés pour vérifier que la porte positive ne comprend pas d’échantillons DiD négatifs.
Des titrages sont nécessaires pour optimiser les signaux de fluorescence
Avant d’exécuter une expérience complète, diverses conditions, y compris la concentration d’anticorps conjugués par fluorescence utilisés lors de la coloration cellulaire et de colorant lipidique utilisé pendant la préparation des liposomes, doivent être optimisées. Les cytomètres de flux ont une limite supérieure de détection pour l’intensité de fluorescence, de sorte que trop de colorant incorporé dans les liposomes conduira à des niveaux non quantifiables de signal DiD dans les échantillons traversant le cytomètre. De plus, trop de DiD dans les liposomes peut entraîner des niveaux élevés de transfert de colorant non spécifique, ce qui pourrait fausser les résultats de l’absorption cellulaire. La figure 3 présente les résultats d’une expérience dans laquelle les concentrations de colorant lipidique ont été titrées pour identifier la concentration qui produirait un signal optimal dans la plage de détection du cytomètre en flux utilisé. Cela a été réalisé sur les tissus d’intérêt pour l’expérience finale: sang (Figure 3A), SVF adipeux inguinal (Figure 3B) et SVF adipeux épididymaire (Figure 3C). Les concentrations sélectionnées pour les tests étaient de 10 mg de DiD (élevé, rouge), 1 mg de DiD (moyen, bleu) ou 0,1 mg de DiD (faible, gris) par 1 mL de liposomes. La concentration la plus élevée utilisée dans les liposomes était trop élevée et dépassait la plage quantifiable du cytomètre dans les trois tissus (Figure 3A\u2012C, rouge). La concentration la plus faible de DiD a montré un certain signal (Figure 3 A\u2012C, gris), mais une population claire au-delà des cellules traitées par PBS (Figure 3 A\u2012C, noir) n’a pas été observée. Lorsqu’elle a été quantifiée, la moyenne arithmétique de l’IFM DiD pour chaque tissu et concentration a démontré une distinction claire entre les témoins PBS et la concentration moyenne de DiD (Figure 3D). Ainsi, comme indiqué dans le protocole, nous avons sélectionné la concentration moyenne (Figure 3, bleu) à utiliser dans notre préparation de liposomes.
L’utilisation d’un panel multi-anticorps permet d’identifier l’absorption des liposomes par différents sous-ensembles cellulaires
À l’aide du panel décrit dans le tableau 3, les cellules ont été colorées avec des anticorps contre les marqueurs des macrophages A, des cellules B, des cellules T, des cellules dendritiques, des monocytes et des cellules endothéliales (Figure 4). Des stratégies de déclenchement légèrement différentes sont nécessaires pour chaque type de tissu, mais la plupart des mêmes types de cellules peuvent être identifiés dans chacun. Certaines exceptions comprennent les cellules endothéliales, qui ne se trouvent normalement pas dans le sang, et les monocytes, qui sont généralement à une fréquence plus élevée dans le sang que les autres tissus. Une fois les populations identifiées, la taille totale de chaque population cellulaire et la fréquence à laquelle elles sont DiD+ peuvent être quantifiées. D’autres calculs peuvent être effectués pour caractériser la population DiD+ : quel pourcentage de cellules DiD+ sont des macrophages, des cellules endothéliales, etc. Veuillez noter qu’il s’agit d’exemples de stratégies de contrôle, mais ce n’est pas la seule façon d’analyser les échantillons. L’analyse sera dictée par le panel sélectionné et le(s) cytomètre(s) de flux disponible(s).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Figure 1 : Exemples de caractéristiques des liposomes préparés. (A) La taille et le potentiel zêta ont été mesurés comme décrit ci-dessus et ont été présentés sous forme de tableau. Chaque paramètre est présenté comme la moyenne ± l’écart-type. (B) Cryo-EM a été utilisé pour imager les liposomes préparés. La barre d’échelle blanche mesure 50 nm de longueur. (C) DLS a été utilisé pour générer un histogramme du diamètre des liposomes dans cette préparation. Cette figure est adaptée d’Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Figure 2 : Coloration DiD représentative de souris traitées au PBS ou aux liposomes. (A) Schéma expérimental pour les traitements PBS et liposomes. PBS ou liposomes ont été injectés trois fois au cours d’une semaine. Les tissus ont été prélevés le jour 8 du traitement. (B, C) Des diagrammes de flux représentatifs révèlent une coloration positive au DiD chez les souris traitées par liposomes (C), mais pas par PBS (B). FSC, diffusion vers l’avant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Figure 3 : Titrage de DiD dans les liposomes. Les liposomes ont été préparés avec trois concentrations différentes de DiD et injectés à des souris. Le gris indique la faible concentration à 0,1 mg DiD par 1 mL de liposomes, le bleu indique la concentration moyenne à 1 mg DiD/mL de liposomes et le rouge indique la concentration élevée à 10 mg DiD/mL de liposomes. Une souris traitée par PBS a été utilisée comme témoin négatif (noire). Le sang (A, cercle), l’adipeux inguinal (B, triange) et l’adipeux épididymaire (C, carré) ont été prélevés 24 heures après l’injection et traités pour isoler une suspension unicellulaire. Ces échantillons ont été exécutés sur un cytomètre en flux au niveau de DiD détectable. Des histogrammes spécifiques aux tissus avec des superpositions de chaque groupe de traitement sont présentés pour démontrer l’intensité de fluorescence par concentration (A\u2012C). La moyenne arithmétique de DiD a également été quantifiée pour chaque tissu et concentration et tracée (D). SSC = dispersion latérale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Figure 4 : Analyse par cytométrie en flux représentative de sous-ensembles cellulaires dans la SVF adipeuse, le sang et la rate. (A\u2012C) Schéma représentatif de la stratégie de déclenchement pour identifier les sous-ensembles cellulaires et les cellules DiD+ dans le SVF adipeux (A), la rate (B) et le sang (C). Abréviations : FSC = diffusion vers l’avant; LD = vivant/mort; L-DCs = cellules dendritiques lymphoïdes; M-DCs = cellules dendritiques myéloïdes; SSC = dispersion latérale. Cette figure est adaptée d’Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Contrôle</td>
			<td>But</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Souris traitée avec PBS ou solution saline</td>
			<td>Utilisez les cellules de cette souris pour les contrôles de cytométrie en flux suivants :</td>
		</tr><tr><td>1. Cellules non colorées</td>
		</tr><tr><td>2. Tache unique vivante / morte</td>
		</tr><tr><td>3. Cellules colorées avec le panneau complet, mais dépourvues de fluorescence liposomique pour déterminer le signal liposomique positif pendant l’analyse</td>
		</tr><tr><td>Cette / ces souris / souris seront également utilisées pour déterminer si les liposomes ont des effets in vivo, car vous aurez un contrôle non liposomique dans votre expérience.</td>
		</tr><tr><td>Liposomes déchargés</td>
			<td>Si vous chargez un composé dans vos liposomes, une partie de votre lot de liposomes doit être synthétisée sans le composé. Cela explique tous les effets in vivo des liposomes seuls.</td>
		</tr><tr><td>DiD seul</td>
			<td>Étant donné que le DiD peut également être absorbé par les membranes cellulaires, l’allocation de certaines souris pour recevoir un colorant libre à une quantité égale à celle trouvée dans les liposomes aidera à tenir compte de toute coloration de la membrane de fond.</td>
		</tr><tr><td>Contrôles de fluorescence moins un (FMO)</td>
			<td>Ce sont des cellules colorées avec tous les anticorps de votre panel sauf un. Comme #3 dans l’encadré ci-dessus, cela aide à déterminer le véritable signal positif pour cet anticorps pendant l’analyse</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Contrôles à utiliser dans ce protocole.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Solution</td>
			<td>Composants</td>
			<td>Volume approximatif nécessaire par lot/souris</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Préparation des liposomes</td>
		</tr><tr><td>Acétate de calcium</td>
			<td>1 M acétate de calcium dansH2O</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampon HEPES</td>
			<td>10 mM HEPES enH2O, pH 7,4</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar dans HEPES</td>
			<td>en 10 mM HEPES</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Récolte, traitement et coloration des tissus</td>
		</tr><tr><td>Solution tamponnée au phosphate (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mMNa2HPO4, 1,8 mM KH 2PO4 dansH2Odistillé</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>PBS-Héparine</td>
			<td>0,1 mM d’héparine dans PBS</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampon HEPES</td>
			<td>20 mM HEPES dans PBS</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampon de digestion</td>
			<td>2 mg/mL de collagénase de type I dans le tampon HEPES</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampon de lyse AKC</td>
			<td>0,158 MNH3Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mMNa2 EDTA dansddH2O, pH 7,2</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampon FACS</td>
			<td>1% BSA, 0,05% NaN3 dans PBS</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>Bloc Fc (dilué)</td>
			<td>Bloc 1:50 Fc dans le tampon FACS</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Tampon de fixation</td>
			<td>2% de paraformaldéhyde dans le PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Solutions à préparer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Un</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloration extracellulaire (2x mélange d’anticorps)</td>
		</tr><tr><td>Antigène</td>
			<td>Fluorophore</td>
			<td>Volume Ab par test de 100 μL</td>
			<td>Volume total nécessaire :</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Colonne C x 1,2 x # total d’échantillons</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μL/essai) x (1,2) x (# échantillons)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/essai) x (1,2) x (# échantillons)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/essai) x (1,2) x (# échantillons)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/essai) x (1,2) x (# échantillons)</td>
		</tr><tr><td>DC31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>etc...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>DC115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Pour créer votre mélange d’anticorps, combinez les anticorps calculés dans la colonne D avec le tampon FACS ou le tampon de coloration violet brillant* jusqu’à un volume final de (50 μL x 1,2 x # échantillons totaux)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Taches vivantes/mortes (1x)</td>
		</tr><tr><td>Vivant/Mort</td>
			<td>Fluorophore</td>
			<td>Volume L/D par essai de 200 uL</td>
			<td>Volume total nécessaire :</td>
		</tr><tr><td>Vivant/Mort</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Colonne C x 1,2 x # total d’échantillons</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloration intracellulaire (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antigène</td>
			<td>Fluorophore</td>
			<td>Volume Ab par test de 50 μL</td>
			<td>Volume total nécessaire :</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Colonne C x 1,2 x # total d’échantillons</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Un tampon de coloration violette brillante doit être utilisé si plus d’un anticorps conjugué à un fluorophore violet brillant est utilisé dans votre panel.</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : Exemple de panel d’anticorps et calculs des mélanges de coloration à utiliser pour la coloration en flux.

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Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

L’objectif de ce protocole est de synthétiser des liposomes marqués par fluorescence et d’utiliser la cytométrie en flux pour identifier la localisation in vivo des liposomes au niveau cellulaire.

Préparation, administration et évaluation de l’absorption cellulaire in vivo de liposomes marqués par un colorant fluorescent

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K vues.  University of Virginia. L’objectif de ce protocole est de synthétiser des liposomes marqués par fluorescence et d’utiliser la cytométrie en flux pour identifier la localisation in vivo des liposomes au niveau cellulaire.

Vidéo: Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Recherche

Bio-ingénierie

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

L&#39;extraction des lipides cellulaires pour ciblées dilution isotopique stable analyse de spectrométrie de masse chromatographie liquide-

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Préparation et Photoacoustique Analyse des véhicules cellulaires contenant de l&#39;or nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo évaluation quantitative de la structure du myocarde, Fonction, perfusion et la viabilité utilisant la tomographie cardiaque Micro-calculées

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Livraison de siRNA thérapeutique du SNC Utilisation cationique et anionique Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Fabrication de Mousses et microsupports dérivés Matrice extracellulaires culture cellulaire spécifique de tissu et plates-formes de livraison

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Préparation, Purification et l’utilisation de Liposomes contenant de l’acide gras

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rigide incrustation du fixe et tachée, ensemble, échelle millimétrique spécimens pour histologie exempt de Section 3D de Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...