Gli autori desiderano ringraziare Michael Solga e il resto dello staff del Flow Cytometry Core per aver fornito formazione e servizi di citometria a flusso. Gli autori desiderano anche riconoscere Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye e Prasad Srikakulapu per la loro assistenza nella preparazione dei liposomi (SSKD, DKB), nella raccolta dei tessuti (MAM, JCG), nella colorazione con citometria a flusso e nell'acquisizione del campione (AU, PS, CM). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 e R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 e T32 HL007284.

<ol>
	<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+from+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 286 (2015).</li><li>Osinski, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liposomal+delivery+of+PPAR&#945;/&#947;+dual+agonist+tesaglitazar+in+a+model+of+obesity+enriches+macrophage+targeting+and+limits+liver+and+kidney+drug+effects.">In vivo liposomal delivery of PPAR&#945;/&#947; dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects.</a> Theranostics. 10 (2), (2020).</li><li>Bauknight, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+thorough+tissue+and+cellular+level+characterization+of+targeted+drugs+in+the+evaluation+of+pharmacodynamic+effects.">Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects.</a> PLoS ONE. 14 (11), (2019).</li><li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+A+Fundamental+Process+in+Immunity.">Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity.</a> BioMed Research International. , (2017).</li><li>He, H., Ghosh, S., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+dysfunctional+macrophage-associated+diseases.">Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases.</a> Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).</li><li>Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+and+the+mononuclear+phagocyte+system:+pharmacokinetics+and+applications+for+inflammatory+diseases.">Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases.</a> Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).</li><li>Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+liposome+size+on+the+circulation+time+and+intraorgan+distribution+of+amphipathic+poly(ethylene+glycol)-containing+liposomes.">Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes.</a> BBA - Biomembranes. , (1994).</li><li>Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+investigating+in+vivo+fate+of+nanoliposomes:+A+review.">Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).</li><li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole+body+biodistribution+of+fluorescent-labeled+agents+by+non-invasive+tomographic+imaging.">Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging.</a> PLoS One. 6 (6), 20594 (2011).</li><li>Larmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence-mediated+tomography+for+quantification+of+urokinase+receptor-dependent+leukocyte+trafficking+in+inflammation.">In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation.</a> Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).</li><li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clodronate+liposomes+improve+metabolic+profile+and+reduce+visceral+adipose+macrophage+content+in+diet-induced+obese+mice.">Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice.</a> PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).</li><li>Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+clodronate+liposomes+eliminates+visceral+adipose+macrophages+and+blocks+high-fat+diet-induced+weight+gain+and+development+of+insulin+resistance.">Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance.</a> The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).</li><li>Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-obesity+and+anti-inflammatory+effects+of+macrophage-targeted+interleukin-10-conjugated+liposomes+in+obese+mice.">Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice.</a> Biomaterials. 110, 81-88 (2016).</li><li>Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+an+active+and+passive+targeting+to+tumor+and+adipose+tissues.">Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).</li><li>Nakhlband, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combating+atherosclerosis+with+targeted+nanomedicines:+Recent+advances+and+future+prospective.">Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective.</a> BioImpacts. , (2018).</li><li>Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+targeted+nanotherapeutic+approach+for+obesity+treatment.">Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment.</a> International Journal of Nanomedicine. , (2018).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> Journal of Cell Biology. , (1986).</li><li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Use+of+Tail+Vein+Metastasis+Assays+and+Real-Time+In+Vivo+Imaging+to+Quantify+Breast+Cancer+Metastatic+Colonization+and+Burden+in+the+Lungs.">Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2019).</li><li>Dasa, S. S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plectin-targeted+liposomes+enhance+the+therapeutic+efficacy+of+a+PARP+inhibitor+in+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer.</a> Theranostics. , (2018).</li><li>Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-mediated+recruitment+of+NK+cells+is+a+critical+host+defense+mechanism+in+invasive+aspergillosis.">Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2003).</li><li>Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jir&#243;n Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestion+of+the+murine+liver+for+a+flow+cytometric+analysis+of+lymphatic+endothelial+cells.">Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e58621 (2019).</li><li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis.">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation research. , (2019).</li><li>O'Brien, C. A., Harris, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain.">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui descriviamo un protocollo in tre parti per (i) preparare liposomi etichettati con un colorante lipidico fluorescente e caricati con un composto antidiabetico, tesaglitazar, (ii) somministrare liposomi a un topo tramite iniezione retro-orbitale e (iii) raccogliere, elaborare e colorare i tessuti per rilevare l'assorbimento dei liposomi a livello cellulare mediante citometria a flusso. Questo protocollo esamina la preparazione di circa 150 μm liposomi e la valutazione dell'assorbimento in adiposo, sangue e milza. La preparazione del liposoma è scalabile, eseguita principalmente a temperatura ambiente e utilizza l'evaporazione a fase inversa per massimizzare il carico del farmaco e la rimozione dei solventi organici. Utilizzando questo protocollo, è possibile ottenere fino a 2 mg/ml di concentrazione di tesaglitazar nel campione di liposoma purificato. I liposomi preparati possono essere conservati in tampone HEPES a 4 °C per oltre un anno. Nella nostra esperienza, hanno dimostrato una variazione minima della dimensione media delle particelle. Meno del 10% della perdita di contenuto di farmaco è stata dimostrata spettrofotometricamente, dopo la separazione per ultrafiltrazione dei liposomi dal farmaco esterno con un filtro centrifugo da 10 kDa.
Durante la preparazione dei liposomi, ci sono alcuni passaggi critici e fattori da considerare. Innanzitutto, l'ordine dei passaggi del protocollo è importante e deve essere rispettato. In secondo luogo, il pH della soluzione utilizzata durante il caricamento di tesaglitazar deve essere mantenuto a 7,4 per massimizzare la solubilità e il carico efficace. In terzo luogo, il corretto assemblaggio di apparecchiature e filtri garantisce che l'output di ogni passaggio sia delle dimensioni e della purezza adeguate. Ad esempio, se i filtri da 100 e 200 nm non sono assemblati correttamente, può verificarsi un lotto di liposomi più eterogeneo e di dimensioni improprie. In quarto luogo, è necessaria la rimozione completa di Ca-acetato prima del carico del farmaco per massimizzare il trasferimento di tesaglitazar nei liposomi. Per testare la rimozione completa del Ca-acetato, utilizzare la sedimentazione ad alta velocità per rimuovere i liposomi e quindi misurare i livelli di Ca-acetato nella soluzione non liposomiale. In quinto luogo, è importante pesare e registrare la massa di tutti i materiali aggiunti alla preparazione del liposoma in ogni fase. Ciò garantisce che possano essere calcolate le concentrazioni corrette e che vengano mantenuti i rapporti necessari dei materiali. Infine, se la tecnica non viene eseguita correttamente, potrebbe esserci un livello indesiderato di eterogeneità. È importante controllare accuratamente questo parametro utilizzando DLS e altri approcci come la microscopia elettronica. Per migliorare l'omogeneità, è consigliabile regolare la dimensione del filtro selezionato o impilare due filtri.
Inoltre, è fondamentale che i controlli e un pannello anticorpale per la citometria a flusso siano pianificati e ottimizzati prima di condurre questo protocollo in modo completo (Tabella 1, Tabella 3). Gli anticorpi devono essere testati per garantire che vengano utilizzate concentrazioni adeguate per la colorazione e che la sovrapposizione tra i fluorofori sia minima. Anche l'eccitazione e l'emissione del colorante utilizzato durante la preparazione dei liposomi devono essere prese in considerazione nella pianificazione del pannello. Nei nostri risultati, abbiamo utilizzato DiD, che ha un'eccitazione ed emissione simili ai fluorofori come l'alloficocianina (APC) e AlexaFluor 647. Pertanto, non abbiamo selezionato anticorpi coniugati a questi fluorofori nel nostro pannello di anticorpi. Inoltre, i controlli isotype non sono inclusi in questo protocollo. Questo perché gli anticorpi selezionati per questo protocollo sono anticorpi ben convalidati e disponibili in commercio. Tuttavia, se interessati a utilizzare un anticorpo che non è stato ottimizzato in precedenza, si prega di considerare di testare l'anticorpo contro un controllo isotipo sui tessuti di interesse prima di condurre l'esperimento completo.
Mentre questo protocollo dimostra come estrarre ed elaborare il sangue, la milza, il tessuto adiposo inguinale e l'epididimo dal topo dopo il trattamento, questo approccio generale può essere applicato ad altri tessuti. A seconda del tessuto di interesse, potrebbe essere necessario modificare i protocolli di elaborazione e digestione come pubblicato per i seguenti tessuti: polmone21, fegato22, cavità peritoneale 3, midollo osseo3,23, cervello24.
Un'importante limitazione di questo metodo da considerare è che l'assorbimento può essere valutato solo in un punto temporale per animale. Pertanto, può essere vantaggioso accoppiare questo protocollo con altre tecniche di imaging non invasive o pianificare di conseguenza per garantire risorse sufficienti per condurre la valutazione. I tempi di assorbimento cellulare e il turn over cellulare sono fattori importanti da considerare: i liposomi circoleranno in tutto il corpo nelle prime 24 ore e, a seconda della durata della vita delle cellule che assorbono i liposomi o di come rispondono all'assorbimento, può verificarsi la morte cellulare o un'ulteriore fagocitosi. Il nostro studio precedente ha dimostrato cambiamenti nelle caratteristiche della popolazione delle popolazioni DiD + in diversi punti temporali3. Per questo motivo, è importante valutare l'assorbimento in punti temporali precedenti o punti temporali più rilevanti per la biologia del meccanismo di interesse. Inoltre, mentre la quantificazione dell'assorbimento cellulare nell'intero tessuto può essere eseguita con questo protocollo, la citometria a flusso non può rivelare la localizzazione tissutale. L'accoppiamento di questo approccio con metodi istologici può aiutare ad affrontare questa limitazione.
In generale, questo protocollo integra la metodologia esistente come l'istologia e l'imaging a fluorescenza di tutto il corpo. Con i continui progressi negli strumenti e nei metodi di citometria a flusso, diventerà possibile lo sviluppo di pannelli più grandi per popolazioni cellulari sempre più specifiche. Suggeriamo che questo protocollo venga utilizzato in aggiunta ai metodi sopra menzionati in quanto ciò migliorerà la valutazione dell'assorbimento cellulare e fornirà anche l'opportunità di convalidare i risultati osservati dalla citometria a flusso. Ad esempio, si dovesse scoprire che la maggior parte delle particelle nel tessuto adiposo sono state assorbite dai macrofagi mediante citometria a flusso. L'immunofluorescenza di un'aliquota aggiuntiva dello stesso tessuto adiposo potrebbe essere salvata, fissata, sezionata e colorata per i marcatori macrofagici per verificare che il tipo di cellula assorba effettivamente i liposomi. Questo approccio dovrebbe aggiungere rigore ai saggi di biodistribuzione delle nanoparticelle condotti: convalidare il targeting specifico delle cellule, quantificare l'assorbimento cellulare, identificare l'assorbimento off-target e, si spera, fornire informazioni per generare ipotesi meccanicistiche per i risultati terapeutici osservati. Questo protocollo può anche essere adattato per studi futuri utilizzando diversi liposomi, studiando l'assorbimento in altri tessuti e testando nuovi composti nel contesto dell'obesità e del dismetabolismo o di qualsiasi altra malattia in cui la consegna di nanoparticelle è un'opzione terapeutica fattibile.

Con l'aumento dell'interesse per lo sviluppo di terapie che utilizzano la somministrazione di farmaci con nanoparticelle, i metodi per preparare e valutare la distribuzione e l'assorbimento delle particelle devono continuare a progredire, espandersi ed essere accessibili alla comunità di ricerca 1,2. Questo protocollo è stato sviluppato per valutare i tipi esatti di cellule che hanno assorbito liposomi in vivo a seguito di un trattamento con liposomi marcati con DiD caricati con tesaglitazar, unagonista 3,4 del recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPAR)-α/γ. In questi studi, siamo stati in grado di valutare quali tipi di cellule sono stati direttamente influenzati dal trattamento liposomiale con tesaglitazar, l'efficacia delle frazioni mirate e generare ipotesi per spiegare i risultati del trattamento che abbiamo osservato. Inoltre, le funzioni biologiche stabilite in una varietà di tipi di cellule suggeriscono che le cellule fagocitiche come i macrofagi, le cellule dendritiche e le cellule di Kupffer specifiche del fegato assorbono la maggior parte dei liposomi 5,6,7. Utilizzando questo protocollo, abbiamo dimostrato che anche i fagociti non classici potrebbero assorbire i liposomi 3,4.
Questo protocollo presenta un metodo ottimizzato per solubilizzare tesaglitazar, preparare liposomi mediante evaporazione a fase inversa e utilizzare l'acetato di calcio come attrattivo per il carico remoto del farmaco. I metodi presentati sono accessibili a molti laboratori e mancano di materiali difficili da acquisire e passaggi che richiedono alte temperature. Il protocollo produce liposomi di dimensioni ottimali per una maggiore circolazione in vivo8. Inoltre, come riassunto da Su et al., ad oggi, sono stati studiati e testati in profondità9 metodi per valutare la distribuzione dei liposomi in vivo e l'assorbimento tissutale. I metodi di tomografia ad emissione di positroni (PET), risonanza magnetica (MRI) e tomografia molecolare a fluorescenza (FMT) vengono applicati per quantificare la biodistribuzione e l'assorbimento tessuto-specifici 9,10,11. Mentre questi metodi sono stati ottimizzati per massimizzare il rilevamento in vivo, mancano ancora della capacità di quantificare l'assorbimento dei liposomi in vivo alla risoluzione cellulare. Il protocollo qui presentato mira a soddisfare questa esigenza attraverso l'uso della citometria a flusso. Infine, per questo protocollo, l'assorbimento cellulare è stato ristretto a pochi tessuti, incluso il tessuto adiposo. C'è un crescente corpo di letteratura che studia il potenziale per l'uso di nanoparticelle per fornire terapie nel contesto di obesità, dismetabolismo e infiammazione 12,13,14,15,16,17. Pertanto, abbiamo ritenuto importante condividere un protocollo con metodi efficaci per l'elaborazione e l'analisi del tessuto adiposo, uno dei tessuti che svolge un ruolo importante in queste patologie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103251</td>
			<td>Clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-1152-82</td>
			<td>Clone AFS98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0114-82</td>
			<td>Clone N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD19 PE CF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562291</td>
			<td>Clone 1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3 FITC antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553061</td>
			<td>Clone 145-2C11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31 BV605</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102427</td>
			<td>Clone 390</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PerCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557235</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>700-107P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting spin-column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89889, 89890</td>
			<td>Zeba spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering, Nicomp 370</td>
			<td>Particle Sizing System, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIX &#38; PERM Cell Permeabilization Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>GAS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Dermacea</td>
			<td>441211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3393-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome extruder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z373400</td>
			<td>LiposoFast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Aqua</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic lubricant</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td></td>
			<td>20g/70 oz Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>433689L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene vial for mincing</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>Re111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Misonix</td>
			<td>XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T/Pump Heat therapy pump and pad</td>
			<td>Gaymer Industries</td>
			<td>TP-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tesaglitazar</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Track-etched polycarbonate membranes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1141Z**</td>
			<td>Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer/DLS-ELS system</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes

C'è un crescente interesse nell'uso dei liposomi per fornire composti in vivo, in particolare per approcci terapeutici mirati. A seconda della formulazione del liposoma, i liposomi possono essere assorbiti preferenzialmente da diversi tipi di cellule nel corpo. Ciò può influenzare l'efficacia della particella terapeutica poiché la progressione di diverse malattie è specifica del tipo di tessuto e della cellula. In questo protocollo, presentiamo un metodo per sintetizzare e marcare fluorescentmente i liposomi usando DSPC, colesterolo e DSPE PEG-2000 e il colorante lipidico DiD come etichetta fluorescente. Questo protocollo presenta anche un approccio per la somministrazione di liposomi in vivo e la valutazione dell'assorbimento cellulo-specifico dei liposomi utilizzando la citometria a flusso. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i tipi di cellule che assorbono i liposomi e quantificare la distribuzione e la proporzione di assorbimento dei liposomi tra i tipi di cellule e i tessuti. Sebbene non menzionati in questo protocollo, ulteriori test come l'immunofluorescenza e l'imaging a fluorescenza a singola cellula su un citometro rafforzeranno qualsiasi risultato o conclusione fatta in quanto consentono la valutazione della colorazione intracellulare. I protocolli possono anche dover essere adattati a seconda del tessuto o dei tessuti di interesse.

Produzione di liposomi
I risultati pubblicati qui sono simili a quelli del nostro lavoro pubblicato in precedenza 3,4,20. Utilizzando il protocollo qui presentato, ci aspettiamo di produrre liposomi di circa 150-160 nm. DLS rivela un diametro medio del liposoma di 163,2 nm e un potenziale zeta di -19,2 mV (Figura 1A). L'imaging criogenico al microscopio elettronico (crio-EM) rivela liposomi circolari (Figura 1B) e il diagramma DLS rivela una deviazione standard relativamente piccola dal diametro medio (Figura 1C).
Il legame positivo dei liposomi richiede un controllo trattato con PBS
Studi precedenti del nostro gruppo che impiegano questo protocollo hanno studiato quali sottogruppi cellulari in SVF adiposo, milza e sangue legato ai liposomi dopo una settimana di somministrazione in vivo 3,4. Utilizzando un topo trattato con PBS, la cavità peritoneale e le cellule della milza sono state colorate con lo stesso pannello anticorpale utilizzato su campioni di topi trattati con liposomi. I tessuti sono stati raccolti dopo una settimana di trattamenti (Figura 2A). I campioni del mouse trattato con PBS sono serviti come FMO DiD con cui creare porte DiD positive (Figura 2B,C). Un gate positivo può essere creato usando il segnale DiD-positivo, ma i campioni privi di segnale DiD devono essere utilizzati anche per verificare che il gate positivo non includa campioni DiD-negativi.
Le titolazioni sono necessarie per ottimizzare i segnali di fluorescenza
Prima di eseguire un esperimento completo, devono essere ottimizzate varie condizioni, tra cui la concentrazione di anticorpi coniugati fluorescentmente utilizzati durante la colorazione cellulare e di colorante lipidico utilizzato durante la preparazione dei liposomi. I citometri a flusso hanno un limite superiore di rilevazione per l'intensità della fluorescenza, quindi troppo colorante incorporato nei liposomi porterà a livelli non quantificabili di segnale DiD nei campioni attraversati dal citometro. Inoltre, troppo DiD nei liposomi può portare ad alti livelli di trasferimento di coloranti non specifici, che potrebbero distorcere i risultati dell'assorbimento cellulare. La figura 3 riporta i risultati di un esperimento in cui le concentrazioni di colorante lipidico sono state titolate per identificare la concentrazione che produrrebbe un segnale ottimale all'interno dell'intervallo di rilevamento del citometro a flusso utilizzato. Questo è stato condotto sui tessuti di interesse per l'esperimento finale: sangue (Figura 3A), SVF adiposo inguinale (Figura 3B) e SVF adiposo epididimo (Figura 3C). Le concentrazioni selezionate per il test erano 10 mg di DiD (alto, rosso), 1 mg di DiD (medio, blu) o 0,1 mg di DiD (basso, grigio) per 1 ml di liposomi. La concentrazione più alta utilizzata nei liposomi era troppo alta e superava l'intervallo quantificabile del citometro in tutti e tre i tessuti (Figura 3A\u2012C, rosso). La concentrazione più bassa di DiD ha mostrato qualche segnale (Figura 3 A\u2012C, grigio), ma non è stata osservata una popolazione chiara oltre le cellule trattate con PBS (Figura 3A\u2012C, nero). Quando quantificata, la media aritmetica della MFI DiD per ciascun tessuto e concentrazione ha dimostrato una chiara distinzione tra i controlli PBS e la concentrazione media di DiD (Figura 3D). Pertanto, come indicato nel protocollo, abbiamo selezionato la concentrazione media (Figura 3, blu) da utilizzare nella nostra preparazione dei liposomi.
L'uso del pannello multi-anticorpo consente l'identificazione dell'assorbimento dei liposomi da parte di diversi sottogruppi cellulari
Utilizzando il pannello delineato nella Tabella 3, le cellule sono state colorate con anticorpi contro marcatori per macrofagi a, cellule B, cellule T, cellule dendritiche, monociti e cellule endoteliali (Figura 4). Sono necessarie strategie di gating leggermente diverse per ogni tipo di tessuto, ma la maggior parte degli stessi tipi di cellule può essere identificata in ciascuno. Alcune eccezioni includono le cellule endoteliali, che normalmente non si trovano nel sangue, e i monociti, che sono tipicamente a più alta frequenza nel sangue rispetto ad altri tessuti. Una volta identificate le popolazioni, è possibile quantificare la dimensione totale di ciascuna popolazione cellulare e la frequenza con cui sono DiD+. Ulteriori calcoli possono essere eseguiti per caratterizzare la popolazione DiD +: quale percentuale di cellule DiD + sono macrofagi, cellule endoteliali, ecc. Si prega di notare che queste sono strategie di gating di esempio, ma non l'unico modo per analizzare i campioni. L'analisi sarà dettata dal pannello selezionato e dal citometro a flusso disponibili.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Figura 1: Caratteristiche di esempio dei liposomi preparati. (A) Le dimensioni e il potenziale zeta sono stati misurati come descritto sopra e sono stati riportati sotto forma di tabella. Ogni parametro è presentato come media ± deviazione standard. (B) Cryo-EM è stato utilizzato per visualizzare i liposomi preparati. La barra della scala bianca è lunga 50 nm. (C) DLS è stato utilizzato per generare un istogramma del diametro dei liposomi in questa preparazione. Questa figura è adattata da Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Figura 2: Colorazione rappresentativa di DiD da topi trattati con PBS o Liposomi. (A) Schema sperimentale per trattamenti PBS e liposomiali. PBS o liposomi sono stati iniettati tre volte nel corso di una settimana. I tessuti sono stati raccolti il giorno 8 del trattamento. (B, C) I grafici di flusso rappresentativi rivelano una colorazione DiD positiva nei topi trattati con liposomi (C), ma non trattati con PBS (B). FSC, dispersione in avanti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Figura 3: Titolazione del DiD nei liposomi. I liposomi sono stati preparati con tre diverse concentrazioni di DiD e iniettati nei topi. Il grigio indica la bassa concentrazione a 0,1 mg di DiD per 1 mL di liposomi, il blu indica la concentrazione media a 1 mg di liposomi DiD/mL e il rosso indica l'alta concentrazione a 10 mg di liposomi DiD/mL. Un mouse trattato con PBS è stato utilizzato come controllo negativo (nero). Il sangue (A, cerchio), l'adiposo inguinale (B, triange) e l'epididimo adiposo (C, quadrato) sono stati raccolti 24 ore dopo l'iniezione e trattati per isolare una sospensione unicellulare. Questi campioni sono stati eseguiti su un citometro a flusso al livello di DiD rilevabile. Vengono presentati istogrammi tessuto-specifici con sovrapposizioni di ciascun gruppo di trattamento per dimostrare l'intensità della fluorescenza per concentrazione (A\u2012C). La media aritmetica di DiD è stata anche quantificata per ciascun tessuto e concentrazione e tracciata (D). SSC = dispersione laterale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Figura 4: Analisi rappresentativa della citometria a flusso di sottogruppi cellulari in SVF adiposo, sangue e milza. (A\u2012C) Rappresentativo schematico della strategia di gating per identificare sottoinsiemi cellulari e cellule DiD+ in SVF adiposo (A), milza (B) e sangue (C). Abbreviazioni: FSC = forward scatter; LD = vivi/morti; L-DC = cellule dendritiche linfoidi; M-DC = cellule dendritiche mieloidi; SSC = dispersione laterale. Questa figura è adattata da Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Controllo</td>
			<td>Scopo</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Mouse trattato con PBS o soluzione salina</td>
			<td>Utilizzare le cellule di questo mouse per i seguenti controlli di citometria a flusso:</td>
		</tr><tr><td>1. Celle non colorate</td>
		</tr><tr><td>2. Macchia singola viva / morta</td>
		</tr><tr><td>3. Cellule colorate con il pannello completo, ma prive della fluorescenza liposomica per determinare il segnale liposomico positivo durante l'analisi</td>
		</tr><tr><td>Questo / questi mouse / topi saranno utilizzati anche per determinare se i liposomi hanno effetti in vivo in quanto si avrà un controllo non liposomico nel vostro esperimento.</td>
		</tr><tr><td>Liposomi scaricati</td>
			<td>Se stai caricando un composto nei tuoi liposomi, una parte del tuo lotto di liposomi dovrebbe essere sintetizzata senza il composto. Questo spiega eventuali effetti in vivo dei soli liposomi.</td>
		</tr><tr><td>DiD da solo</td>
			<td>Poiché il DiD può anche essere assorbito dalle membrane cellulari, allocare alcuni topi per ricevere colorante libero in una quantità pari a quella trovata nei liposomi aiuterà a spiegare qualsiasi colorazione della membrana di fondo.</td>
		</tr><tr><td>Controlli a fluorescenza meno uno (FMO)</td>
			<td>Queste sono cellule colorate con tutti tranne uno degli anticorpi nel tuo pannello. Come #3 nella casella sopra, questo aiuta a determinare il vero segnale positivo per quell'anticorpo durante l'analisi</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Controlli da utilizzare in questo protocollo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Soluzione</td>
			<td>Componenti</td>
			<td>Volume approssimativo necessario per batch/mouse</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Preparazione dei liposomi</td>
		</tr><tr><td>Acetato di calcio</td>
			<td>1 M acetato di calcio in H2O</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampone HEPES</td>
			<td>10 mM HEPES in H2O, pH 7,4</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar in HEPES</td>
			<td>in 10 mM HEPES</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Raccolta, lavorazione e colorazione dei tessuti</td>
		</tr><tr><td>Soluzione tamponata fosfato (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO4 in H 2O distillato</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr><tr><td>PBS-Eparina</td>
			<td>0,1 mM di eparina in PBS</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampone HEPES</td>
			<td>20 mM HEPES in PBS</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampone di digestione</td>
			<td>2 mg/mL di collagenasi di tipo I nel tampone HEPES</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Tampone di lisi AKC</td>
			<td>0,158 m NH 3 cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA in ddH 2 O, pH7,2</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>Buffer FACS</td>
			<td>1% BSA, 0,05% NaN3 in PBS</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>Blocco Fc (diluito)</td>
			<td>Blocco Fc 1:50 nel buffer FACS</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Buffer di fissazione</td>
			<td>2% paraformaldeide in PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Soluzioni da preparare.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Un</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Colorazione extracellulare (2x mix di anticorpi)</td>
		</tr><tr><td>Antigene</td>
			<td>Fluoroforo</td>
			<td>Volume Ab per 100 μL di prova</td>
			<td>Volume totale necessario:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Colonna C x 1,2 x Totale # esempi</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μL/test) x (1,2) x (# campioni)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/test) x (1,2) x (# campioni)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/test) x (1,2) x (# campioni)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/test) x (1,2) x (# campioni)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>and so on...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Per creare la tua miscela di anticorpi, combina gli anticorpi calcolati nella colonna D con tampone FACS o tampone colorante viola brillante* per un volume finale di (50 μL x 1,2 x campioni # totali)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Colorazione viva/morta (1x)</td>
		</tr><tr><td>Vivi/Morti</td>
			<td>Fluoroforo</td>
			<td>Volume L/D per 200 uL test</td>
			<td>Volume totale necessario:</td>
		</tr><tr><td>Vivi/Morti</td>
			<td>Acqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Colonna C x 1,2 x Totale # esempi</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Colorazione intracellulare (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antigene</td>
			<td>Fluoroforo</td>
			<td>Volume Ab per prova da 50 μL</td>
			<td>Volume totale necessario:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Colonna C x 1,2 x Totale # esempi</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Il tampone per colorazione viola brillante deve essere utilizzato se nel pannello viene utilizzato più di un anticorpo coniugato a un fluoroforo viola brillante.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Esempio di pannello anticorpale e calcoli delle miscele di colorazione da utilizzare per la colorazione del flusso.

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Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

L'obiettivo di questo protocollo è sintetizzare liposomi marcati con fluorescenza e utilizzare la citometria a flusso per identificare la localizzazione in vivo dei liposomi a livello cellulare.

Preparazione, somministrazione e valutazione dell'assorbimento cellulare tessuto-specifico in vivo di liposomi marcati con coloranti fluorescenti

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K Views.  University of Virginia. L'obiettivo di questo protocollo è sintetizzare liposomi marcati con fluorescenza e utilizzare la citometria a flusso per identificare la localizzazione in vivo dei liposomi a livello cellulare.

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Ricerca

Bioingegneria

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Preparazione e fotoacustico Analisi dei veicoli cellulari contenenti oro Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitativa valutazione della struttura del miocardio, la funzione, la perfusione e sostenibilità Utilizzando cardiaca micro-tomografia computerizzata

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

La consegna dei terapeutica siRNA al SNC Utilizzando cationici e anionici liposomi

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Preparazione, purificazione e l'uso dei liposomi contenenti acidi grassi

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rigida incorporamento di fisso e macchiato, complesso, scala millimetrata esemplari per l'istologia privo di sezione 3D da Micro-tomografia computerizzata

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...