Os autores gostariam de agradecer a Michael Solga e ao resto da equipe do Núcleo de Citometria de Fluxo por fornecer treinamento e serviços de citometria de fluxo. Os autores também gostariam de agradecer a Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye e Prasad Srikakulapu por sua assistência com a preparação de lipossomas (SSKD, DKB), colheitas de tecidos (MAM, JCG) e coloração por citometria de fluxo e aquisição de amostras (AU, PS, CM). Este trabalho foi apoiado por AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 e R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 e T32 HL007284 subvenções.

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain.">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui descrevemos um protocolo de três partes para (i) preparar lipossomas que são marcados com um corante lipídico fluorescente e carregados com um composto antidiabético, tesaglitazar, (ii) administrar lipossomas a um camundongo via injeção retro-orbital e (iii) coletar, processar e corar tecidos para detectar a captação de lipossomas em nível celular por citometria de fluxo. Este protocolo revisa o preparo de lipossomas de aproximadamente 150 μm e a avaliação da captação no tecido adiposo, no sangue e no baço. A preparação dos lipossomas é escalável, realizada principalmente à temperatura ambiente, e utiliza evaporação em fase reversa para maximizar a carga de fármacos e remoção de solventes orgânicos. Usando este protocolo, até 2 mg/mL de tesaglitazar pode ser alcançado na amostra de lipossomas purificada. Os lipossomas preparados podem ser armazenados em tampão HEPES a 4 °C por mais de um ano. Em nossa experiência, eles demonstraram variação mínima do tamanho médio das partículas. Menos de 10% de perda de conteúdo do fármaco foi demonstrada espectrofotometricamente, após separação por ultrafiltração dos lipossomas do fármaco externo com filtro centrífugo de 10 kDa.
Durante a preparação do lipossoma, existem algumas etapas e fatores críticos a serem considerados. Primeiramente, a ordem das etapas do protocolo é importante e deve ser respeitada. Em segundo lugar, o pH da solução utilizada durante o carregamento do tesaglitazar deve ser mantido em 7,4 para maximizar a solubilidade e o carregamento eficaz. Terceiro, a montagem adequada de equipamentos e filtros garante que a saída de cada etapa seja do tamanho e pureza adequados. Por exemplo, se os filtros de 100 e 200 nm não forem montados corretamente, um lote mais heterogêneo e de tamanho inadequado de lipossomas pode resultar. Quarto, a remoção completa do acetato de Ca-antes do carregamento da droga é necessária para maximizar a transferência de tesaglitazar para os lipossomas. Para testar a remoção completa de Ca-acetato, use sedimentação de alta velocidade para remover os lipossomas e, em seguida, medir os níveis de Ca-acetato na solução não lipossomal. Em quinto lugar, é importante pesar e registrar a massa de todos os materiais adicionados ao preparo dos lipossomas em cada etapa. Isso garante que as concentrações adequadas possam ser calculadas e as proporções necessárias de materiais sejam mantidas. Finalmente, se a técnica não for executada adequadamente, pode haver um nível indesejável de heterogeneidade. É importante verificar minuciosamente este parâmetro usando DLS e outras abordagens, como a microscopia eletrônica. Para melhorar a homogeneidade, considere ajustar o tamanho do filtro selecionado ou empilhar dois filtros.
Além disso, é fundamental que os controles e um painel de anticorpos para citometria de fluxo sejam planejados e otimizados antes da realização completa desse protocolo (Tabela 1, Tabela 3). Os anticorpos devem ser testados para garantir que concentrações adequadas sejam usadas para coloração e que a sobreposição entre os fluoróforos seja mínima. A excitação e emissão do corante usado durante a preparação dos lipossomas também devem ser levadas em consideração no planejamento do painel. Em nossos resultados, utilizamos o DiD, que tem excitação e emissão semelhantes a fluoróforos como Aloficocianina (APC) e AlexaFluor 647. Assim, não selecionamos anticorpos conjugados a esses fluoróforos em nosso painel de anticorpos. Além disso, controles isotípicos não estão incluídos neste protocolo. Isso ocorre porque os anticorpos selecionados para esse protocolo são anticorpos bem validados e disponíveis comercialmente. No entanto, se estiver interessado em usar um anticorpo que não tenha sido otimizado anteriormente, considere testar o anticorpo contra um controle de isótipo nos tecidos de interesse antes de realizar o experimento completo.
Embora este protocolo demonstre como extrair e processar o sangue, baço, tecido adiposo inguinal e tecido adiposo epididimal do camundongo pós-tratamento, esta abordagem geral pode ser aplicada a outros tecidos. Dependendo do tecido de interesse, os protocolos de processamento e digestão podem precisar ser alterados, como é publicado para os seguintes tecidos: pulmão 21, fígado22, cavidade peritoneal 3, medula óssea3,23, cérebro 24.
Uma limitação importante deste método a considerar é que a captação só pode ser avaliada em um momento por animal. Assim, pode ser vantajoso acoplar este protocolo a outras técnicas de imagem não invasivas ou planejar adequadamente para garantir recursos suficientes para a realização da avaliação. O tempo de captação celular e o turnover celular são fatores importantes a serem considerados: os lipossomas circularão por todo o corpo nas primeiras 24 h e, dependendo da vida útil das células que absorvem lipossomas ou como eles respondem à captação, pode ocorrer morte celular ou fagocitose adicional. Nosso estudo anterior demonstrou mudanças nas características populacionais de populações DiD+ em diferentes momentos3. Por essa razão, é importante avaliar a captação em momentos anteriores ou em momentos mais relevantes para a biologia do mecanismo de interesse. Além disso, embora a quantificação da captação celular em todo o tecido possa ser realizada com esse protocolo, a citometria de fluxo não pode revelar a localização tecidual. O acoplamento dessa abordagem com métodos histológicos pode ajudar a resolver essa limitação.
Em geral, esse protocolo complementa a metodologia existente, como a histologia e a imagem de fluorescência de corpo inteiro. Com os avanços contínuos nas ferramentas e métodos de citometria de fluxo, o desenvolvimento de painéis maiores para populações celulares cada vez mais específicas se tornará possível. Sugerimos que este protocolo seja utilizado em adição aos métodos supracitados, pois melhorará a avaliação da captação celular e também proporcionará a oportunidade de validar os resultados observados por citometria de fluxo. Por exemplo, caso se verifique que a maioria das partículas no tecido adiposo foi absorvida por macrófagos por citometria de fluxo. A imunofluorescência de uma alíquota adicional do mesmo tecido adiposo poderia ser salva, fixada, seccionada e corada para marcadores de macrófagos para verificar se o tipo celular realmente absorve lipossomas. Essa abordagem deve adicionar rigor aos ensaios de biodistribuição de nanopartículas realizados: validação de alvos específicos para células, quantificação da captação celular, identificação de captação fora do alvo e, esperançosamente, fornecer informações para gerar hipóteses mecanicistas para os resultados terapêuticos observados. Este protocolo também pode ser adaptado para estudos futuros utilizando diferentes lipossomas, investigando a captação em outros tecidos e testando novos compostos no contexto de obesidade e dismetabolismo ou qualquer outra doença em que a liberação de nanopartículas seja uma opção terapêutica viável.

À medida que cresce o interesse no desenvolvimento de terapias utilizando nanopartículas para liberação de fármacos, os métodos para preparar e avaliar a distribuição e absorção de partículas devem continuar avançando, expandindo-se e sendo acessíveis à comunidade de pesquisa 1,2. Esse protocolo foi desenvolvido para avaliar os tipos celulares exatos que absorveram lipossomas in vivo após um tratamento com lipossomas marcados com DiD carregados com tesaglitazar, um agonista do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma (PPAR)-α/γ 3,4. Nesses estudos, pudemos avaliar quais tipos celulares foram diretamente impactados pelo tratamento com tesaglitazar lipossomal, a eficácia de direcionar metades e gerar hipóteses para explicar os resultados do tratamento observados. Além disso, funções biológicas estabelecidas em uma variedade de tipos celulares sugerem que células fagocíticas como macrófagos, células dendríticas e células de Kupffer hepatoespecíficas absorvem a maioria dos lipossomas 5,6,7. Utilizando este protocolo, demonstramos que fagócitos não clássicos também poderiam absorver lipossomas 3,4.
Este protocolo apresenta um método otimizado para solubilização do tesaglitazar, preparo de lipossomas por evaporação em fase reversa e uso de acetato de cálcio como atrativo para carregamento remoto de fármacos. Os métodos apresentados são acessíveis a muitos laboratórios e carecem de materiais de difícil aquisição e etapas que exigem altas temperaturas. O protocolo produz lipossomas de tamanhos ideais para o aumento da circulação invivo8. Além disso, como resumido por Su et al., até o momento, métodos para avaliar in vivo a distribuição de lipossomas e a captação tecidual têm sido estudados e testados emprofundidade9. Os métodos de tomografia por emissão de pósitrons (PET), ressonância magnética (RM) e tomografia molecular de fluorescência (FMT) são aplicados para quantificar a biodistribuição e captação tecido-específica9,10,11. Embora esses métodos tenham sido otimizados para maximizar a detecção in vivo, eles ainda não têm a capacidade de quantificar a captação de lipossomas in vivo na resolução celular. O protocolo aqui apresentado visa suprir essa necessidade por meio do uso da citometria de fluxo. Finalmente, para esse protocolo, a captação celular foi reduzida a alguns tecidos, incluindo o tecido adiposo. Há uma crescente literatura investigando o potencial do uso de nanopartículas para administrar terapias no contexto de obesidade, dismetabolismo e inflamação 12,13,14,15,16,17. Como tal, sentimos que era importante partilhar um protocolo com métodos eficazes para processar e analisar o tecido adiposo – um dos tecidos que desempenha um papel importante nestas patologias.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103251</td>
			<td>Clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-1152-82</td>
			<td>Clone AFS98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0114-82</td>
			<td>Clone N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD19 PE CF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562291</td>
			<td>Clone 1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3 FITC antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553061</td>
			<td>Clone 145-2C11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31 BV605</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102427</td>
			<td>Clone 390</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PerCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557235</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>700-107P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting spin-column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89889, 89890</td>
			<td>Zeba spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering, Nicomp 370</td>
			<td>Particle Sizing System, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIX &#38; PERM Cell Permeabilization Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>GAS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Dermacea</td>
			<td>441211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3393-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome extruder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z373400</td>
			<td>LiposoFast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Aqua</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic lubricant</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td></td>
			<td>20g/70 oz Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>433689L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene vial for mincing</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>Re111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Misonix</td>
			<td>XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T/Pump Heat therapy pump and pad</td>
			<td>Gaymer Industries</td>
			<td>TP-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tesaglitazar</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Track-etched polycarbonate membranes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1141Z**</td>
			<td>Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer/DLS-ELS system</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes

Há um interesse crescente no uso de lipossomas para entregar compostos in vivo, particularmente para abordagens de tratamento direcionadas. Dependendo da formulação do lipossoma, os lipossomas podem ser preferencialmente absorvidos por diferentes tipos de células no corpo. Isso pode influenciar a eficácia da partícula terapêutica, uma vez que a progressão de diferentes doenças é específica do tipo tecidual e celular. Neste protocolo, apresentamos um método para síntese e marcação fluorescente de lipossomas usando DSPC, colesterol e DSPE PEG-2000 e o corante lipídico DiD como marcador fluorescente. Este protocolo também apresenta uma abordagem para a administração de lipossomas in vivo e avaliação da captação célula-específica de lipossomas usando citometria de fluxo. Esta abordagem pode ser usada para determinar os tipos de células que absorvem lipossomas e quantificar a distribuição e proporção de captação de lipossomas entre tipos celulares e tecidos. Embora não mencionados neste protocolo, ensaios adicionais, como imunofluorescência e imagem de fluorescência de célula única em um citômetro, fortalecerão quaisquer achados ou conclusões feitas, pois permitem a avaliação da coloração intracelular. Os protocolos também podem precisar ser adaptados dependendo do(s) tecido(s) de interesse.

Produção de Lipossomas
Os resultados aqui publicados são semelhantes aos de nosso trabalho publicado anteriormente 3,4,20. Utilizando o protocolo aqui apresentado, esperamos produzir lipossomas de aproximadamente 150\u2012160 nm de tamanho. A DLS revela diâmetro médio dos lipossomas de 163,2 nm e potencial zeta de -19,2 mV (Figura 1A). A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) revela lipossomas circulares (Figura 1B) e o diagrama DLS revela um desvio padrão relativamente pequeno do diâmetro médio (Figura 1C).
A ligação positiva aos lipossomas requer um controle tratado com PBS
Estudos anteriores de nosso grupo empregando esse protocolo investigaram quais subtipos celulares em FVS, baço e sangue adiposos se ligavam a lipossomas após uma semana de administração in vivo 3,4. Usando um camundongo tratado com PBS, as células da cavidade peritoneal e do baço foram coradas com o mesmo painel de anticorpos usado em amostras de camundongos tratados com lipossomas. Os tecidos foram colhidos após uma semana de tratamentos (Figura 2A). As amostras do camundongo tratado com PBS serviram como um FMO DiD com o qual criar portas DiD positivas (Figura 2B,C). Uma porta positiva pode ser criada usando o sinal DiD-positivo, mas amostras sem sinal DiD também devem ser usadas para verificar se a porta positiva não inclui amostras DiD-negativas.
Titulações são necessárias para otimizar sinais de fluorescência
Antes de executar um experimento completo, várias condições, incluindo a concentração de anticorpos fluorescentemente conjugados usados durante a coloração celular e de corante lipídico usado durante a preparação de lipossomas, devem ser otimizadas. Os citômetros de fluxo têm um limite superior de detecção para intensidade de fluorescência, então muito corante incorporado nos lipossomas levará a níveis não quantificáveis de sinal DiD em amostras que passam pelo citômetro. Além disso, muito DiD nos lipossomas pode levar a altos níveis de transferência de corante inespecífico, o que poderia distorcer os resultados de captação celular. A Figura 3 relata os resultados de um experimento em que as concentrações de corante lipídico foram tituladas para identificar a concentração que produziria um sinal ótimo dentro da faixa de detecção do citômetro de fluxo utilizado. Este foi realizado nos tecidos de interesse para o experimento final: sangue (Figura 3A), FVS adiposa inguinal (Figura 3B) e FVS adiposa epididimal (Figura 3C). As concentrações selecionadas para teste foram 10 mg de DiD (Alto, vermelho), 1 mg de DiD (Médio, azul) ou 0,1 mg de DiD (Baixo, cinza) por 1 mL de lipossomas. A maior concentração utilizada nos lipossomas foi muito alta e ultrapassou a faixa quantificável do citômetro nos três tecidos (Figura 3A\u2012C, vermelho). A menor concentração de DiD mostrou algum sinal (Figura 3 A\u2012C, cinza), mas uma população clara além das células tratadas com PBS (Figura 3A\u2012C, preto) não foi observada. Quando quantificada, a média aritmética da IFM DiD para cada tecido e concentração demonstrou uma clara distinção entre os controles PBS e a concentração média de DiD (Figura 3D). Assim, conforme indicado no protocolo, selecionamos a concentração média (Figura 3, azul) para utilizar em nosso preparo lipossomo.
O uso do painel de múltiplos anticorpos permite a identificação da captação de lipossomas por diferentes subgrupos celulares
Utilizando o painel delineado na Tabela 3, as células foram coradas com anticorpos contra marcadores para macrófagos A, células B, células T, células dendríticas, monócitos e células endoteliais (Figura 4). Estratégias de gating ligeiramente diferentes são necessárias para cada tipo de tecido, mas a maioria dos mesmos tipos celulares pode ser identificada em cada um. Algumas exceções incluem células endoteliais, que normalmente não são encontradas no sangue, e monócitos, que normalmente estão em maior frequência no sangue do que outros tecidos. Uma vez identificadas as populações, pode-se quantificar o tamanho total de cada célula e a frequência com que são DiD+. Cálculos adicionais podem ser realizados para caracterizar a população DiD+: qual porcentagem de células DiD+ são macrófagos, células endoteliais, etc. Por favor, note que estas são estratégias de gating exemplo, mas não a única maneira de analisar as amostras. A análise será ditada pelo painel selecionado e citômetro(s) de fluxo disponíveis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Figura 1: Exemplo de características dos lipossomas preparados. (A) O tamanho e o potencial zeta foram medidos como descrito acima e foram relatados em forma de tabela. Cada parâmetro é apresentado como média ± desvio padrão. (B) Crio-ME foi utilizada para obtenção de imagens dos lipossomas preparados. A barra de escala branca tem 50 nm de comprimento. (C) A DLS foi utilizada para gerar um histograma do diâmetro dos lipossomas nessa preparação. Esta figura é adaptada de Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Figura 2: Coloração DiD representativa de camundongos tratados com PBS ou Lipossoma. (A) Esquema experimental para PBS e tratamentos com lipossomas. PBS ou lipossomas foram injetados três vezes ao longo de uma semana. Os tecidos foram colhidos no 8º dia de tratamento. (B, C) Fluxogramas representativos revelam coloração DiD positiva em camundongos tratados com lipossomas (C), mas não tratados com PBS (B). FSC, dispersão para a frente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Figura 3: Titulação de DiD em lipossomas. Lipossomas foram preparados com três diferentes concentrações de DiD e injetados em camundongos. O cinza indica a baixa concentração em 0,1 mg de DiD por 1 mL de lipossomas, o azul indica a concentração média em 1 mg de DiD/mL de lipossomas e o vermelho indica a alta concentração em 10 mg de DiD/mL de lipossomas. Um camundongo tratado com PBS foi usado como controle negativo (preto). Sangue (A, círculo), adiposo inguinal (B, triango) e adiposo epididimal (C, quadrado) foram colhidos 24 h após a injeção e processados para isolar uma suspensão unicelular. Essas amostras foram executadas em citômetro de fluxo até o nível de DiD detectável. Histogramas tecido-específicos com sobreposições de cada grupo de tratamento são apresentados para demonstrar a intensidade de fluorescência por concentração (A\u2012C). A média aritmética do DiD também foi quantificada para cada tecido e concentração e plotada (D). SSC = dispersão lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Figura 4: Análise representativa da citometria de fluxo dos subgrupos celulares em FVS adiposa, sangue e baço. (A\u2012C) Representação esquemática da estratégia de gating para identificar subgrupos celulares e células DiD+ em FVA adiposa (A), baço (B) e sangue (C). Abreviações: FSC = forward scatter; DL = vivos/mortos; L-DCs = células dendríticas linfoides; M-DCs = células dendríticas mieloides; SSC = dispersão lateral. Esta figura é adaptada de Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Controle</td>
			<td>Propósito</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Camundongo tratado com PBS ou soro fisiológico</td>
			<td>Use as células deste mouse para os seguintes controles de citometria de fluxo:</td>
		</tr><tr><td>1. Células não coradas</td>
		</tr><tr><td>2. Mancha única viva/morta</td>
		</tr><tr><td>3. Células coradas com o painel completo, mas sem fluorescência lipossomal para determinar o sinal positivo do lipossomo durante a análise</td>
		</tr><tr><td>Este/estes ratinhos/ratinhos também serão utilizados para determinar se os lipossomas têm efeitos in vivo, uma vez que terá um controlo não lipossomal na sua experiência.</td>
		</tr><tr><td>Lipossomas descarregados</td>
			<td>Se você estiver carregando um composto em seus lipossomas, uma parte do seu lote de lipossomas deve ser sintetizada sem o composto. Isso explica quaisquer efeitos in vivo dos lipossomas sozinhos.</td>
		</tr><tr><td>DiD sozinho</td>
			<td>Uma vez que o DiD também pode ser absorvido pelas membranas celulares, alocar alguns ratos para receber corante livre em uma quantidade igual à encontrada nos lipossomas ajudará a explicar qualquer coloração de membrana de fundo.</td>
		</tr><tr><td>Controles de fluorescência-menos-um (FMO)</td>
			<td>Estas são células coradas com todos os anticorpos, exceto um, em seu painel. Como #3 na caixa acima, isso ajuda a determinar o verdadeiro sinal positivo para esse anticorpo durante a análise</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Controles a serem usados neste protocolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Solução</td>
			<td>Componentes</td>
			<td>Volume aproximado necessário por lote/mouse</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Preparação de lipossomas</td>
		</tr><tr><td>Acetato de cálcio</td>
			<td>1 M de acetato de cálcio em H2O</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampão HEPES</td>
			<td>10 mM HEPES em A2O, pH 7,4</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar em HEPES</td>
			<td>em 10 mM HEPES</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Colheita, processamento e coloração de tecidos</td>
		</tr><tr><td>Solução tamponada com fosfato (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO4 em destilado H2O</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>PBS-Heparina</td>
			<td>Heparina 0,1 mM em PBS</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampão HEPES</td>
			<td>20 mM HEPES em PBS</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampão de digestão</td>
			<td>2 mg/mL de colagenase Tipo I em tampão HEPES</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Buffer de lise AKC</td>
			<td>0,158 M NH 3 Cl,10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA em ddH 2 O, pH7,2</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>Buffer FACS</td>
			<td>1% BSA, 0,05% NaN3 em PBS</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>Bloco Fc (diluído)</td>
			<td>Bloco Fc 1:50 no buffer FACS</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Buffer de Fixação</td>
			<td>Paraformaldeído a 2% em PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Soluções a serem preparadas.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Um</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloração extracelular (2x mistura de anticorpos)</td>
		</tr><tr><td>Antígeno</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Volume ab por teste de 100 μL</td>
			<td>Volume total necessário:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Coluna C x 1,2 x Total # amostras</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5,5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μL/teste) x (1,2) x (# amostras)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/teste) x (1,2) x (# amostras)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/teste) x (1,2) x (# amostras)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/teste) x (1,2) x (# amostras)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>etc...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Para criar sua mistura de anticorpos, combine os anticorpos calculados na coluna D com o tampão FACS ou o Brilliant Violet Staining Buffer* para um volume final de (50 μL x 1,2 x Total # amostras)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloração viva/morta (1x)</td>
		</tr><tr><td>Vivo/Morto</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Volume L/D por teste de 200 uL</td>
			<td>Volume total necessário:</td>
		</tr><tr><td>Vivo/Morto</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Coluna C x 1,2 x Total # amostras</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloração Intracelular (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antígeno</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Volume Ab por teste de 50 μL</td>
			<td>Volume total necessário:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Coluna C x 1,2 x Total # amostras</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Brilliant Violet Staining Buffer deve ser usado se mais de um anticorpo conjugado a um fluoróforo Brilliant Violet estiver sendo usado em seu painel.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Exemplo de painel de anticorpos e cálculos de misturas de coloração a serem utilizadas para coloração de fluxo.

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Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

O objetivo deste protocolo é sintetizar lipossomas fluorescentemente marcados e usar citometria de fluxo para identificar a localização in vivo de lipossomas em nível celular.

Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K visualizações.  University of Virginia. O objetivo deste protocolo é sintetizar lipossomas fluorescentemente marcados e usar citometria de fluxo para identificar a localização in vivo de lipossomas em nível celular.

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Preparação de Matrizes Reclamação para Quantificar contração celular

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Bioengenharia

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Preparação e Fotoacústica Análise de Veículos celulares contendo ouro nanobastões

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitativa Avaliação da Estrutura do miocárdio, função, perfusão e viabilidade Usando Cardiac Micro-Tomografia Computadorizada

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Preparação, purificação e utilização de lipossomas contendo ácido graxo

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...