저자는 유세포 분석 교육 및 서비스를 제공한 Michael Solga와 나머지 Flow Cytometry Core 직원에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 리포솜 준비(SSKD, DKB), 조직 수확(MAM, JCG), 유세포 분석 염색 및 샘플 수집(AU, PS, CM)에 도움을 준 Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye 및 Prasad Srikakulapu에게 감사를 표합니다. 이 작업은 AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 및 R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 및 T32 HL007284 보조금의 지원을 받았습니다.

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M., Mehrad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-mediated+recruitment+of+NK+cells+is+a+critical+host+defense+mechanism+in+invasive+aspergillosis.">Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2003).</li><li>Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jir&#243;n Tamburini, B. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain.">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li></ol>

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여기에서는 (i) 형광 지질 염료로 표지되고 항당뇨 화합물인 테사글리타자르가 로드된 리포솜을 준비하고, (ii) 역궤도 주사를 통해 마우스에 리포솜을 투여하고, (iii) 유세포 분석을 통해 세포 수준에서 리포솜 흡수를 감지하기 위해 조직을 수확, 처리 및 염색합니다. 이 프로토콜은 약 150μm 리포솜의 준비와 지방, 혈액 및 비장의 흡수 평가를 검토합니다. 리포솜 제제는 확장 가능하고 대부분 실온에서 수행되며 역상 증발을 활용하여 약물 로딩 및 유기 용매 제거를 극대화합니다. 이 프로토콜을 사용하면 정제된 리포솜 샘플에서 최대 2mg/mL 테사글리타자르 농도를 달성할 수 있습니다. 제조된 리포솜은 4°C의 HEPES 완충액에 1년 이상 보관할 수 있습니다. 우리의 경험에서, 그들은 평균 입자 크기의 최소한의 변화를 보여주었습니다. 10kDa 원심 필터를 사용하여 외부 약물로부터 리포솜을 한외여과 분리한 후 10% 미만의 약물 함량 손실이 분광광도계로 입증되었습니다.
리포솜을 준비하는 동안 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계와 요소가 있습니다. 첫째, 프로토콜 단계의 순서가 중요하며 준수해야 합니다. 둘째, 테사글리타자르를 로딩할 때 사용되는 용액의 pH는 용해도와 효과적인 로딩을 최대화하기 위해 7.4로 유지되어야 합니다. 셋째, 장비와 필터의 적절한 조립은 각 단계의 출력이 적절한 크기와 순도를 갖도록 합니다. 예를 들어, 100nm 및 200nm 필터가 제대로 조립되지 않으면 더 이질적이고 부적절한 크기의 리포솜 배치가 발생할 수 있습니다. 넷째, 테사글리타자르가 리포솜으로 전달되는 것을 최대화하기 위해서는 약물 로딩 전에 Ca-아세테이트를 완전히 제거해야 합니다. Ca-아세테이트의 완전한 제거를 테스트하려면 고속 침전을 사용하여 리포솜을 제거한 다음 비리포솜 용액에서 Ca-아세테이트 수준을 측정합니다. 다섯째, 각 단계에서 리포솜 제제에 첨가되는 모든 물질의 질량을 측정하고 기록하는 것이 중요합니다. 이를 통해 적절한 농도를 계산할 수 있고 필요한 재료 비율을 유지할 수 있습니다. 마지막으로, 기술이 제대로 실행되지 않으면 바람직하지 않은 수준의 이질성이 있을 수 있습니다. DLS 및 전자 현미경과 같은 다른 접근 방식을 사용하여 이 매개변수를 철저히 확인하는 것이 중요합니다. 균질성을 향상시키려면 선택한 필터 크기를 조정하거나 두 개의 필터를 쌓는 것이 좋습니다.
또한 이 프로토콜을 완전히 수행하기 전에 유세포 분석을 위한 대조군 및 항체 패널을 계획하고 최적화하는 것이 중요합니다(표 1, 표 3). 항체는 염색에 적절한 농도가 사용되고 형광단 간의 겹침이 최소화되는지 확인하기 위해 테스트해야 합니다. 리포솜 준비 중에 사용되는 염료의 여기 및 방출도 패널 계획에 포함되어야 합니다. 우리의 결과에서, 우리는 Allophycocyanin (APC) 및 AlexaFluor 647과 같은 형광단과 유사한 여기 및 방출을 갖는 DiD를 활용했습니다. 따라서, 우리는 항체 패널에서 이러한 형광단에 접합된 항체를 선택하지 않았습니다. 또한 isotype 컨트롤은 이 프로토콜에 포함되지 않습니다. 이는 이 프로토콜을 위해 선택된 항체가 잘 검증되고 상업적으로 이용 가능한 항체이기 때문입니다. 그러나 이전에 최적화되지 않은 항체를 사용하는 데 관심이 있는 경우 전체 실험을 수행하기 전에 관심 조직의 이소타입 대조군에 대해 항체를 테스트하는 것을 고려하십시오.
이 프로토콜은 치료 후 마우스에서 혈액, 비장, 사타구니 지방 및 부고환 지방 조직을 추출하고 처리하는 방법을 보여주지만 이 일반적인 접근 방식은 다른 조직에 적용할 수 있습니다. 관심 조직에 따라 처리 및 소화 프로토콜을 변경해야 할 수도 있습니다: 폐21, 간22, 복강강 3, 골수3,23, 뇌 24.
고려해야 할 이 방법의 중요한 한계는 흡수가 동물당 한 시점에서만 평가될 수 있다는 것입니다. 따라서, 이 프로토콜을 다른 비침습적 이미징 기술과 결합하거나 평가를 수행하기 위한 충분한 자원을 보장하기 위해 그에 따라 계획하는 것이 유리할 수 있다. 리포솜은 처음 24시간 동안 몸 전체를 순환하며 리포솜을 흡수하는 세포의 수명 또는 흡수에 반응하는 방식에 따라 세포 사멸 또는 추가 식균 작용이 발생할 수 있습니다. 우리의 이전 연구는 다른 시점에서 DiD+ 인구의 인구 특성의 변화를 보여주었습니다3. 이러한 이유로 관심 메커니즘의 생물학과 가장 관련이 있는 초기 시점 또는 시점에서의 섭취를 평가하는 것이 중요합니다. 또한 이 프로토콜을 사용하여 전체 조직에서 세포 흡수의 정량화를 수행할 수 있지만 유세포 분석으로는 조직 국소화를 밝힐 수 없습니다. 이 접근법을 조직학적 방법과 결합하면 이러한 한계를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.
일반적으로 이 프로토콜은 조직학 및 전신 형광 이미징과 같은 기존 방법론을 보완합니다. 유세포 분석 도구 및 방법의 지속적인 발전으로 점점 더 구체적인 세포 집단에 대한 더 큰 패널의 개발이 가능해질 것입니다. 앞서 언급한 방법과 함께 이 프로토콜을 사용하면 세포 흡수 평가가 향상되고 유세포 분석으로 관찰된 결과를 검증할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 지방 조직에 있는 대부분의 입자가 유세포 분석에 의해 대식세포에 흡수되었다는 것이 밝혀져야 합니다. 동일한 지방 조직의 추가 분취액의 면역형광은 세포 유형이 실제로 리포솜을 흡수하는지 확인하기 위해 대식세포 마커에 대해 저장, 고정, 절편 및 염색될 수 있습니다. 이 접근법은 세포 특이적 표적화 검증, 세포 흡수 정량화, 표적 이탈 흡수 식별, 관찰된 치료 결과에 대한 기계론적 가설을 생성하기 위한 정보 제공 등 수행된 나노입자 생체분포 분석에 엄격함을 더해야 합니다. 이 프로토콜은 또한 다른 리포솜을 사용하고, 다른 조직에서의 흡수를 조사하고, 비만 및 대사 장애 또는 나노 입자 전달이 실현 가능한 치료 옵션인 기타 질병 환경에서 새로운 화합물을 테스트하는 향후 연구에 적용할 수 있습니다.

나노입자 약물 전달을 활용한 치료법 개발에 대한 관심이 높아짐에 따라 입자 분포 및 흡수를 준비하고 평가하는 방법은 계속해서 발전, 확장 및 연구 커뮤니티에서 접근할 수 있어야 합니다 1,2. 이 프로토콜은 과산화소체 증식제 활성화 수용체(PPAR)-α/γ 작용제인 테사글리타자르(tesaglitazar)가 로드된 DiD 표지 리포솜으로 처리한 후 생체 내에서 리포솜을 흡수한 정확한 세포 유형을 평가하기 위해 개발되었습니다 3,4. 이 연구에서 우리는 리포솜 테사글리타자르 치료에 의해 직접적인 영향을 받는 세포 유형, 표적 모이어티의 효능을 평가하고 관찰한 치료 결과를 설명하기 위한 가설을 생성할 수 있었습니다. 또한, 다양한 세포 유형에서 확립된 생물학적 기능은 대식세포, 수지상 세포 및 간 특이적 쿠퍼 세포와 같은 식세포가 리포솜의 대부분을 차지한다는 것을 시사합니다 5,6,7. 이 프로토콜을 활용하여 우리는 비고전적 식세포도 리포솜 3,4를 흡수할 수 있음을 입증했습니다.
이 프로토콜은 테사글리타자르를 가용화하고, 역상 증발에 의해 리포솜을 준비하고, 원격 약물 로딩을 위한 유인제로 칼슘 아세테이트를 사용하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다. 제시된 방법은 많은 실험실에서 접근할 수 있으며 고온이 필요한 구하기 어려운 재료와 단계가 부족합니다. 이 프로토콜은 생체 내 순환 증가에 최적인 크기의 리포솜을 생산한다8. 또한, Su et al.에 의해 요약된 바와 같이, 현재까지 생체 내 리포솜 분포 및 조직 흡수를 평가하는 방법이 깊이9에서 연구되고 테스트되었습니다. 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 자기 공명 영상 (MRI) 및 형광 분자 단층 촬영 (FMT) 방법을 사용하여 조직 특이 적 생체 분포 및 흡수를 정량화합니다 9,10,11. 이러한 방법은 생체 내 검출을 극대화하도록 최적화되었지만 세포 분해능에서 생체 내 리포솜 흡수를 정량화하는 능력은 여전히 부족합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 이러한 요구를 달성하는 것을 목표로 합니다. 마지막으로, 이 프로토콜의 경우 세포 흡수를 지방 조직을 포함한 몇 가지 조직으로 좁혔습니다. 비만, 신진 대사 장애 및 염증 12,13,14,15,16,17의 환경에서 치료법을 전달하기 위해 나노 입자를 사용할 가능성을 조사하는 문헌이 늘어나고 있습니다. 따라서 우리는 이러한 병리에서 중요한 역할을 하는 조직 중 하나인 지방 조직을 처리하고 분석하기 위한 효과적인 방법과 프로토콜을 공유하는 것이 중요하다고 느꼈습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103251</td>
			<td>Clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-1152-82</td>
			<td>Clone AFS98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0114-82</td>
			<td>Clone N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD19 PE CF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562291</td>
			<td>Clone 1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3 FITC antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553061</td>
			<td>Clone 145-2C11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31 BV605</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102427</td>
			<td>Clone 390</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PerCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557235</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>700-107P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting spin-column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89889, 89890</td>
			<td>Zeba spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering, Nicomp 370</td>
			<td>Particle Sizing System, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIX &#38; PERM Cell Permeabilization Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>GAS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Dermacea</td>
			<td>441211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3393-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome extruder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z373400</td>
			<td>LiposoFast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Aqua</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic lubricant</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td></td>
			<td>20g/70 oz Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>433689L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene vial for mincing</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>Re111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Misonix</td>
			<td>XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T/Pump Heat therapy pump and pad</td>
			<td>Gaymer Industries</td>
			<td>TP-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tesaglitazar</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Track-etched polycarbonate membranes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1141Z**</td>
			<td>Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer/DLS-ELS system</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes

특히 표적 치료 접근법을 위해 생체 내에서 화합물을 전달하기 위해 리포솜을 사용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 리포솜 제형에 따라 리포솜은 신체의 다른 세포 유형에 의해 우선적으로 흡수될 수 있습니다. 이는 상이한 질환의 진행이 조직- 및 세포-유형-특이적이기 때문에 치료용 입자의 효능에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜에서는 DSPC, 콜레스테롤, PEG-2000 DSPE 및 지질 염료 DiD를 형광 표지로 사용하여 리포솜을 합성하고 형광 표지하는 한 가지 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 또한 생체 내에서 리포솜을 전달하고 유세포 분석을 사용하여 리포솜의 세포 특이적 흡수를 평가하기 위한 접근 방식을 제시합니다. 이 접근법은 리포솜을 흡수하는 세포 유형을 결정하고 세포 유형 및 조직 전반에 걸쳐 리포솜 흡수의 분포와 비율을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 언급되지 않았지만 세포계의 면역형광 및 단일 세포 형광 이미징과 같은 추가 분석은 세포내 염색을 평가할 수 있으므로 모든 결과 또는 결론을 강화할 것입니다. 프로토콜은 관심 조직에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.

리포솜 생산
여기에 게시 된 결과는 이전에 게시 된 작업 3,4,20의 결과와 유사합니다. 여기에 제시된 프로토콜을 활용하여 약 150-150nm 크기의 리포솜을 생산할 것으로 예상합니다. DLS는 163.2 nm의 평균 리포솜 직경과 -19.2 mV의 제타 전위를 나타냅니다(그림 1A). 극저온 전자 현미경(Cryo-EM) 이미징은 원형 리포솜을 보여주며(그림 1B), DLS 다이어그램은 평균 직경에서 상대적으로 작은 표준 편차를 보여줍니다(그림 1C).
양성 리포솜 결합에는 PBS 처리된 대조군이 필요합니다.
이 프로토콜을 사용하는 우리 그룹의 이전 연구에서는 생체 내 투여 1주 후 지방 SVF, 비장 및 혈액의 세포 하위 집합이 리포솜에 결합하는지 조사했습니다 3,4. PBS 처리된 마우스를 사용하여, 복강 및 비장 세포를 리포좀 처리된 마우스로부터의 샘플에 사용된 것과 동일한 항체 패널로 염색하였다. 처리 1주일 후에 조직을 채취하였다(도 2A). PBS 처리된 마우스의 샘플은 양성 DiD 게이트를 생성하는 DiD FMO 역할을 했습니다(그림 2B,C). DiD 양성 신호를 사용하여 포지티브 게이트를 생성할 수 있지만 DiD 신호가 없는 샘플은 양성 게이트에 DiD 음성이 포함되어 있지 않은지 확인하는 데에도 사용해야 합니다.
형광 신호를 최적화하기 위해 적정이 필요합니다
전체 실험을 실행하기 전에 세포 염색 중에 사용되는 형광 접합 항체의 농도 및 리포솜 준비 중에 사용되는 지질 염료의 농도를 포함한 다양한 조건을 최적화해야 합니다. 유세포 분석기는 형광 강도에 대한 검출 상한이 있으므로 리포솜에 너무 많은 염료가 포함되면 세포분석기를 통과하는 샘플에서 정량화할 수 없는 수준의 DiD 신호가 발생합니다. 또한 리포솜에 DiD가 너무 많으면 높은 수준의 비특이적 염료 전달이 발생하여 세포 흡수 결과가 왜곡될 수 있습니다. 그림 3은 사용된 유세포분석기의 검출 범위 내에서 최적의 신호를 생성할 수 있는 농도를 식별하기 위해 지질 염료의 농도를 적정한 실험의 결과를 보고합니다. 이것은 최종 실험을 위해 관심 조직인 혈액(그림 3A), 사타구니 지방 SVF(그림 3B) 및 부고환 지방 SVF(그림 3C)에 대해 수행되었습니다. 테스트를 위해 선택된 농도는 리포솜 1mL당 10mg의 DiD(높음, 빨간색), 1mg DiD(중간, 파란색) 또는 0.1mg의 DiD(낮음, 회색)였습니다. 리포솜에 사용된 최고 농도는 너무 높았고 세 조직 모두에서 세포분석기의 정량화 가능한 범위를 초과했습니다(그림 3A\u2012C, 빨간색). DiD의 가장 낮은 농도는 약간의 신호를 보였지만(그림 3 A\u2012C, 회색), PBS 처리된 세포(그림 3A\u2012C, 검은색)를 넘어서는 명확한 집단은 관찰되지 않았습니다. 정량화할 때 각 조직 및 농도에 대한 DiD MFI의 산술 평균은 PBS 대조군과 DiD 중간 농도 간의 명확한 차이를 보여주었습니다(그림 3D). 따라서 프로토콜에 표시된 대로 리포솜 준비에 사용할 중간 농도(그림 3, 파란색)를 선택했습니다.
다중 항체 패널을 사용하면 서로 다른 세포 하위 집합에 의한 리포솜 흡수를 식별할 수 있습니다
표 3에 요약된 패널을 사용하여, 세포를 대식세포, B 세포, T 세포, 수지상 세포, 단핵구 및 내피 세포에 대한 마커에 대한 항체로 염색하였다(도 4). 각 조직 유형에 대해 약간 다른 게이팅 전략이 필요하지만 각각에서 동일한 세포 유형의 대부분을 식별할 수 있습니다. 일부 예외에는 일반적으로 혈액에서 발견되지 않는 내피 세포와 일반적으로 다른 조직보다 혈액에서 더 높은 빈도를 갖는 단핵구가 포함됩니다. 집단이 식별되면 각 세포 집단의 총 크기와 DiD+ 빈도를 정량화할 수 있습니다. DiD+ 모집단을 특성화하기 위해 추가 계산을 수행할 수 있습니다: DiD+ 세포의 몇 퍼센트가 대식세포, 내피 세포 등인지. 이는 게이팅 전략의 예이지만 샘플을 분석하는 유일한 방법은 아닙니다. 분석은 선택한 패널과 사용 가능한 유세포 분석기에 의해 결정됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> 그림 1: 제조된 리포좀의 특성 예. (A) 크기 및 제타 전위는 전술한 바와 같이 측정되었으며, 표 형태로 보고되었다. 각 모수는 표준 편차± 평균으로 표시됩니다. (B) Cryo-EM을 사용하여 제조된 리포좀을 이미지화했습니다. 흰색 눈금 막대의 길이는 50nm입니다. (C) DLS는 이 프렙에서 리포솜의 직경의 히스토그램을 생성하는 데 사용되었습니다. 이 그림은 Osinski et al.3에서 발췌한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> 그림 2: PBS 또는 리포솜 처리된 마우스의 대표적인 DiD 염색. (A) PBS 및 리포솜 치료에 대한 실험적 개략도. PBS 또는 리포솜을 1주일 동안 3회 주사하였다. 조직은 치료 8일째에 적출하였다. (비, 씨) 대표적인 흐름 플롯은 리포솜 처리(C)에서 양성 DiD 염색을 나타내지만 PBS 처리(B) 마우스에서는 그렇지 않습니다. FSC, 전방 산란. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> 그림 3: 리포솜의 DiD 적정. 리포솜은 세 가지 다른 농도의 DiD로 준비되고 마우스에 주입되었습니다. 회색은 리포솜 1mL당 0.1mg DiD에서 낮은 농도를 나타내고, 파란색은 1mg DiD/mL 리포솜에서 중간 농도를 나타내며, 빨간색은 10mg DiD/mL 리포솜에서 높은 농도를 나타냅니다. PBS 처리된 마우스를 음성 대조군(검정색)으로 사용하였다. 혈액(A, 원), 사타구니 지방(B, 삼각형) 및 부고환 지방(C, 사각형)을 주사 후 24시간 후에 수확하고 처리하여 단세포 현탁액을 분리했습니다. 이 샘플은 유세포 분석기에서 검출 가능한 DiD 수준까지 실행되었습니다. 농도당 형광 강도(A\u2012C)를 입증하기 위해 각 처리 그룹의 오버레이가 있는 조직별 히스토그램이 제공됩니다. DiD의 산술 평균도 각 조직 및 농도에 대해 정량화하고 플롯팅했습니다(D). SSC = 측면 산란. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> 그림 4: 지방 SVF, 혈액 및 비장의 세포 하위 집합에 대한 대표적인 유세포 분석 분석. (A\u2012C) 지방 SVF(A), 비장(B) 및 혈액(C)에서 세포 하위 집합 및 DiD+ 세포를 식별하기 위한 게이팅 전략의 개략도를 나타냅니다. 약어: FSC = 전방 산란; LD = 살아있는/죽은; L-DCs = 림프성 수지상 세포; M-DCs = 골수 수지상 세포; SSC = 측면 산란. 이 그림은 Osinski et al.3에서 발췌한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>제어</td>
			<td>목적</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">PBS 또는 식염수로 치료한 마우스</td>
			<td>이 마우스의 세포를 사용하여 다음과 같은 유세포 분석 제어를 수행할 수 있습니다.</td>
		</tr><tr><td>1. 염색되지 않은 세포</td>
		</tr><tr><td>2. 살아있는/죽은 단일 얼룩</td>
		</tr><tr><td>3. 전체 패널로 염색되었지만 분석 중 리포솜 양성 신호를 결정하기 위한 리포솜 형광이 부족한 세포</td>
		</tr><tr><td>이 / 이 마우스 / 마우스는 실험에서 비 리포솜 대조군을 갖기 때문에 리포솜이 생체 내에서 어떤 영향을 미치는지 확인하는 데에도 사용됩니다.</td>
		</tr><tr><td>언로딩된 리포솜</td>
			<td>리포솜에 화합물을 로드하는 경우 리포솜 배치의 일부는 화합물 없이 합성되어야 합니다. 이것은 리포솜 단독의 생체 내 효과를 설명합니다.</td>
		</tr><tr><td>DiD 단독</td>
			<td>DiD는 또한 세포막에 의해 흡수 될 수 있기 때문에, 리포솜에서 발견되는 것과 동일한 양으로 유리 염료를 받기 위해 일부 마우스를 할당하면 배경 막 염색을 설명하는 데 도움이 될 것입니다.</td>
		</tr><tr><td>FMO(Fluorescence-minus-one) 제어</td>
			<td>이들은 패널에 있는 항체 중 하나를 제외한 모든 항체로 염색된 세포입니다. 위 상자의 #3과 마찬가지로 분석 중에 해당 항체에 대한 진양성 신호를 결정하는 데 도움이 됩니다</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 이 프로토콜에서 사용할 컨트롤
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>용액</td>
			<td>구성 요소</td>
			<td>배치/마우스당 필요한 대략적인 부피</td>
		</tr><tr><td colspan="3">리포솜 준비</td>
		</tr><tr><td>칼슘 아세테이트</td>
			<td>H2O중 1 M 칼슘 아세테이트</td>
			<td>50 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>hepes 버퍼</td>
			<td>H2O, pH 7.4에서 10 mM HEPES</td>
			<td>50 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>헤페스의 테사글리타자르</td>
			<td>10mM 헤페스에서</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">조직 채취, 가공 및 염색</td>
		</tr><tr><td>인산염 완충 용액(PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 중 증류된 H2O</td>
			<td>2 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>PBS-헤파린</td>
			<td>PBS의 0.1 mM 헤파린</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>hepes 버퍼</td>
			<td>PBS의 20mM HEPES</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>소화 완충액</td>
			<td>HEPES 완충액의 2mg/mL Collagenase Type I</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>AKC 용해 완충액</td>
			<td>ddH2O, pH 7.2에서 0.158 MNH3Cl, 10 mMKHCO3, 0.1 mMNa2EDTA</td>
			<td>15 mL의</td>
		</tr><tr><td>FACS 버퍼</td>
			<td>PBS에서 1% BSA, 0.05%NaN3</td>
			<td>15 mL의</td>
		</tr><tr><td>Fc 블록 (희석)</td>
			<td>FACS 버퍼의 1:50 Fc 블록</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>고정 버퍼</td>
			<td>PBS의 2% 파라포름알데히드</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 준비할 솔루션.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">세포외 염색(2x 항체 혼합물)</td>
		</tr><tr><td>항원</td>
			<td>형광단</td>
			<td>100 μL 시험당 Ab 부피</td>
			<td>필요한 총 볼륨:</td>
		</tr><tr><td>CD45 (CD45)</td>
			<td>퍼CP</td>
			<td>0.5 μL</td>
			<td>컬럼 C x 1.2 x 총 # 샘플</td>
		</tr><tr><td>CD11b입니다</td>
			<td>퍼씨프 Cy5.5</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>(0.5 μL/테스트) x (1.2) x (# 샘플)</td>
		</tr><tr><td>F4/80 키</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>(0.25 μL/테스트) x (1.2) x (# 샘플)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594〈화이트〉</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0.25 μL/테스트) x (1.2) x (# 샘플)</td>
		</tr><tr><td>CD3 (영어)</td>
			<td>핏</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1.0 μL/테스트) x (1.2) x (# 샘플)</td>
		</tr><tr><td>CD31 (영어)</td>
			<td>BV605 시리즈</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>등...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115 (CD115)</td>
			<td>체육</td>
			<td>1.5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">항체 혼합물을 만들려면 컬럼 D에서 계산된 항체를 FACS 버퍼 또는 브릴리언트 바이올렛 염색 버퍼*와 결합하여 최종 부피(50μL x 1.2 x 총 # 샘플)로 만듭니다.</td>
		</tr><tr><td colspan="4">라이브/데드 염색(1x)</td>
		</tr><tr><td>라이브/데드</td>
			<td>형광단</td>
			<td>200 uL 테스트 당 L / D 부피</td>
			<td>필요한 총 볼륨:</td>
		</tr><tr><td>라이브/데드</td>
			<td>아쿠아</td>
			<td>0.67 μL</td>
			<td>컬럼 C x 1.2 x 총 # 샘플</td>
		</tr><tr><td colspan="4">세포내 염색(1x)</td>
		</tr><tr><td>항원</td>
			<td>형광단</td>
			<td>50 μL 시험당 Ab 부피</td>
			<td>필요한 총 볼륨:</td>
		</tr><tr><td>αSMA (영문)</td>
			<td>핏</td>
			<td>0.125</td>
			<td>컬럼 C x 1.2 x 총 # 샘플</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*브릴리언트 바이올렛 염색 버퍼는 브릴리언트 바이올렛 형광단에 결합된 항체가 두 개 이상 패널에 사용되는 경우 사용해야 합니다.</td>
		</tr></tbody></table>표 3: 유동 염색에 사용할 염색 혼합물의 예시 및 항체 패널 계산.

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Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

이 프로토콜의 목표는 형광 표지된 리포솜을 합성하고 유세포 분석을 사용하여 세포 수준에서 리포솜의 생체 내 국소화를 식별하는 것입니다.

형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

연구

생체공학

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

태반의 맞은 편에 생체이 물과 나노 물질의 전송 속도의 결정을 사용하여<em&gt; 생체</em&gt; 인간 태반 관류 모델

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Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

금 나노 막대를 포함하는 세포 차량의 제조 및 광 음향 분석

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

심근 구조, 기능의 생체 양적 평가에서 관류 및 생존 능력은 심장 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

준비, 정화, 및 지방산 포함 된 리의 사용

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

엄밀한 포함의 고정 및 스테인드, 전체, 마이크로 단층에 의해 섹션-무료 3D 조직학에 대 한 밀리미터 단위 표본

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...