저자는 유세포 분석 교육 및 서비스를 제공한 Michael Solga와 나머지 Flow Cytometry Core 직원에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 리포솜 준비(SSKD, DKB), 조직 수확(MAM, JCG), 유세포 분석 염색 및 샘플 수집(AU, PS, CM)에 도움을 준 Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye 및 Prasad Srikakulapu에게 감사를 표합니다. 이 작업은 AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 및 R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 및 T32 HL007284 보조금의 지원을 받았습니다.

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에서는 (i) 형광 지질 염료로 표지되고 항당뇨 화합물인 테사글리타자르가 로드된 리포솜을 준비하고, (ii) 역궤도 주사를 통해 마우스에 리포솜을 투여하고, (iii) 유세포 분석을 통해 세포 수준에서 리포솜 흡수를 감지하기 위해 조직을 수확, 처리 및 염색합니다. 이 프로토콜은 약 150μm 리포솜의 준비와 지방, 혈액 및 비장의 흡수 평가를 검토합니다. 리포솜 제제는 확장 가능하고 대부분 실온에서 수행되며 역상 증발을 활용하여 약물 로딩 및 유기 용매 제거를 극대화합니다. 이 프로토콜을 사용하면 정제된 리포솜 샘플에서 최대 2mg/mL 테사글리타자르 농도를 달성할 수 있습니다. 제조된 리포솜은 4°C의 HEPES 완충액에 1년 이상 보관할 수 있습니다. 우리의 경험에서, 그들은 평균 입자 크기의 최소한의 변화를 보여주었습니다. 10kDa 원심 필터를 사용하여 외부 약물로부터 리포솜을 한외여과 분리한 후 10% 미만의 약물 함량 손실이 분광광도계로 입증되었습니다.
리포솜을 준비하는 동안 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계와 요소가 있습니다. 첫째, 프로토콜 단계의 순서가 중요하며 준수해야 합니다. 둘째, 테사글리타자르를 로딩할 때 사용되는 용액의 pH는 용해도와 효과적인 로딩을 최대화하기 위해 7.4로 유지되어야 합니다. 셋째, 장비와 필터의 적절한 조립은 각 단계의 출력이 적절한 크기와 순도를 갖도록 합니다. 예를 들어, 100nm 및 200nm 필터가 제대로 조립되지 않으면 더 이질적이고 부적절한 크기의 리포솜 배치가 발생할 수 있습니다. 넷째, 테사글리타자르가 리포솜으로 전달되는 것을 최대화하기 위해서는 약물 로딩 전에 Ca-아세테이트를 완전히 제거해야 합니다. Ca-아세테이트의 완전한 제거를 테스트하려면 고속 침전을 사용하여 리포솜을 제거한 다음 비리포솜 용액에서 Ca-아세테이트 수준을 측정합니다. 다섯째, 각 단계에서 리포솜 제제에 첨가되는 모든 물질의 질량을 측정하고 기록하는 것이 중요합니다. 이를 통해 적절한 농도를 계산할 수 있고 필요한 재료 비율을 유지할 수 있습니다. 마지막으로, 기술이 제대로 실행되지 않으면 바람직하지 않은 수준의 이질성이 있을 수 있습니다. DLS 및 전자 현미경과 같은 다른 접근 방식을 사용하여 이 매개변수를 철저히 확인하는 것이 중요합니다. 균질성을 향상시키려면 선택한 필터 크기를 조정하거나 두 개의 필터를 쌓는 것이 좋습니다.
또한 이 프로토콜을 완전히 수행하기 전에 유세포 분석을 위한 대조군 및 항체 패널을 계획하고 최적화하는 것이 중요합니다(표 1, 표 3). 항체는 염색에 적절한 농도가 사용되고 형광단 간의 겹침이 최소화되는지 확인하기 위해 테스트해야 합니다. 리포솜 준비 중에 사용되는 염료의 여기 및 방출도 패널 계획에 포함되어야 합니다. 우리의 결과에서, 우리는 Allophycocyanin (APC) 및 AlexaFluor 647과 같은 형광단과 유사한 여기 및 방출을 갖는 DiD를 활용했습니다. 따라서, 우리는 항체 패널에서 이러한 형광단에 접합된 항체를 선택하지 않았습니다. 또한 isotype 컨트롤은 이 프로토콜에 포함되지 않습니다. 이는 이 프로토콜을 위해 선택된 항체가 잘 검증되고 상업적으로 이용 가능한 항체이기 때문입니다. 그러나 이전에 최적화되지 않은 항체를 사용하는 데 관심이 있는 경우 전체 실험을 수행하기 전에 관심 조직의 이소타입 대조군에 대해 항체를 테스트하는 것을 고려하십시오.
이 프로토콜은 치료 후 마우스에서 혈액, 비장, 사타구니 지방 및 부고환 지방 조직을 추출하고 처리하는 방법을 보여주지만 이 일반적인 접근 방식은 다른 조직에 적용할 수 있습니다. 관심 조직에 따라 처리 및 소화 프로토콜을 변경해야 할 수도 있습니다: 폐21, 간22, 복강강 3, 골수3,23, 뇌 24.
고려해야 할 이 방법의 중요한 한계는 흡수가 동물당 한 시점에서만 평가될 수 있다는 것입니다. 따라서, 이 프로토콜을 다른 비침습적 이미징 기술과 결합하거나 평가를 수행하기 위한 충분한 자원을 보장하기 위해 그에 따라 계획하는 것이 유리할 수 있다. 리포솜은 처음 24시간 동안 몸 전체를 순환하며 리포솜을 흡수하는 세포의 수명 또는 흡수에 반응하는 방식에 따라 세포 사멸 또는 추가 식균 작용이 발생할 수 있습니다. 우리의 이전 연구는 다른 시점에서 DiD+ 인구의 인구 특성의 변화를 보여주었습니다3. 이러한 이유로 관심 메커니즘의 생물학과 가장 관련이 있는 초기 시점 또는 시점에서의 섭취를 평가하는 것이 중요합니다. 또한 이 프로토콜을 사용하여 전체 조직에서 세포 흡수의 정량화를 수행할 수 있지만 유세포 분석으로는 조직 국소화를 밝힐 수 없습니다. 이 접근법을 조직학적 방법과 결합하면 이러한 한계를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.
일반적으로 이 프로토콜은 조직학 및 전신 형광 이미징과 같은 기존 방법론을 보완합니다. 유세포 분석 도구 및 방법의 지속적인 발전으로 점점 더 구체적인 세포 집단에 대한 더 큰 패널의 개발이 가능해질 것입니다. 앞서 언급한 방법과 함께 이 프로토콜을 사용하면 세포 흡수 평가가 향상되고 유세포 분석으로 관찰된 결과를 검증할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 지방 조직에 있는 대부분의 입자가 유세포 분석에 의해 대식세포에 흡수되었다는 것이 밝혀져야 합니다. 동일한 지방 조직의 추가 분취액의 면역형광은 세포 유형이 실제로 리포솜을 흡수하는지 확인하기 위해 대식세포 마커에 대해 저장, 고정, 절편 및 염색될 수 있습니다. 이 접근법은 세포 특이적 표적화 검증, 세포 흡수 정량화, 표적 이탈 흡수 식별, 관찰된 치료 결과에 대한 기계론적 가설을 생성하기 위한 정보 제공 등 수행된 나노입자 생체분포 분석에 엄격함을 더해야 합니다. 이 프로토콜은 또한 다른 리포솜을 사용하고, 다른 조직에서의 흡수를 조사하고, 비만 및 대사 장애 또는 나노 입자 전달이 실현 가능한 치료 옵션인 기타 질병 환경에서 새로운 화합물을 테스트하는 향후 연구에 적용할 수 있습니다.

나노입자 약물 전달을 활용한 치료법 개발에 대한 관심이 높아짐에 따라 입자 분포 및 흡수를 준비하고 평가하는 방법은 계속해서 발전, 확장 및 연구 커뮤니티에서 접근할 수 있어야 합니다 1,2. 이 프로토콜은 과산화소체 증식제 활성화 수용체(PPAR)-α/γ 작용제인 테사글리타자르(tesaglitazar)가 로드된 DiD 표지 리포솜으로 처리한 후 생체 내에서 리포솜을 흡수한 정확한 세포 유형을 평가하기 위해 개발되었습니다 3,4. 이 연구에서 우리는 리포솜 테사글리타자르 치료에 의해 직접적인 영향을 받는 세포 유형, 표적 모이어티의 효능을 평가하고 관찰한 치료 결과를 설명하기 위한 가설을 생성할 수 있었습니다. 또한, 다양한 세포 유형에서 확립된 생물학적 기능은 대식세포, 수지상 세포 및 간 특이적 쿠퍼 세포와 같은 식세포가 리포솜의 대부분을 차지한다는 것을 시사합니다 5,6,7. 이 프로토콜을 활용하여 우리는 비고전적 식세포도 리포솜 3,4를 흡수할 수 있음을 입증했습니다.
이 프로토콜은 테사글리타자르를 가용화하고, 역상 증발에 의해 리포솜을 준비하고, 원격 약물 로딩을 위한 유인제로 칼슘 아세테이트를 사용하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다. 제시된 방법은 많은 실험실에서 접근할 수 있으며 고온이 필요한 구하기 어려운 재료와 단계가 부족합니다. 이 프로토콜은 생체 내 순환 증가에 최적인 크기의 리포솜을 생산한다8. 또한, Su et al.에 의해 요약된 바와 같이, 현재까지 생체 내 리포솜 분포 및 조직 흡수를 평가하는 방법이 깊이9에서 연구되고 테스트되었습니다. 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 자기 공명 영상 (MRI) 및 형광 분자 단층 촬영 (FMT) 방법을 사용하여 조직 특이 적 생체 분포 및 흡수를 정량화합니다 9,10,11. 이러한 방법은 생체 내 검출을 극대화하도록 최적화되었지만 세포 분해능에서 생체 내 리포솜 흡수를 정량화하는 능력은 여전히 부족합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 이러한 요구를 달성하는 것을 목표로 합니다. 마지막으로, 이 프로토콜의 경우 세포 흡수를 지방 조직을 포함한 몇 가지 조직으로 좁혔습니다. 비만, 신진 대사 장애 및 염증 12,13,14,15,16,17의 환경에서 치료법을 전달하기 위해 나노 입자를 사용할 가능성을 조사하는 문헌이 늘어나고 있습니다. 따라서 우리는 이러한 병리에서 중요한 역할을 하는 조직 중 하나인 지방 조직을 처리하고 분석하기 위한 효과적인 방법과 프로토콜을 공유하는 것이 중요하다고 느꼈습니다.

<table><tbody><tr><td>1-mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10-mL syringe</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Clone AFS98</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Clone 1D3</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 FITC antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Clone 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Clone 390</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Desalting spin-column</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Zeba spin column</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering, Nicomp 370</td><td>Particle Sizing System, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX &amp;amp; PERM Cell Permeabilization Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Gauze sponges</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Liposome extruder</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic lubricant</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz Sterile</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene vial for mincing</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Heat therapy pump and pad</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Track-etched polycarbonate membranes</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS system</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes

특히 표적 치료 접근법을 위해 생체 내에서 화합물을 전달하기 위해 리포솜을 사용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 리포솜 제형에 따라 리포솜은 신체의 다른 세포 유형에 의해 우선적으로 흡수될 수 있습니다. 이는 상이한 질환의 진행이 조직- 및 세포-유형-특이적이기 때문에 치료용 입자의 효능에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜에서는 DSPC, 콜레스테롤, PEG-2000 DSPE 및 지질 염료 DiD를 형광 표지로 사용하여 리포솜을 합성하고 형광 표지하는 한 가지 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 또한 생체 내에서 리포솜을 전달하고 유세포 분석을 사용하여 리포솜의 세포 특이적 흡수를 평가하기 위한 접근 방식을 제시합니다. 이 접근법은 리포솜을 흡수하는 세포 유형을 결정하고 세포 유형 및 조직 전반에 걸쳐 리포솜 흡수의 분포와 비율을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 언급되지 않았지만 세포계의 면역형광 및 단일 세포 형광 이미징과 같은 추가 분석은 세포내 염색을 평가할 수 있으므로 모든 결과 또는 결론을 강화할 것입니다. 프로토콜은 관심 조직에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.

리포솜 생산
여기에 게시 된 결과는 이전에 게시 된 작업 3,4,20의 결과와 유사합니다. 여기에 제시된 프로토콜을 활용하여 약 150-150nm 크기의 리포솜을 생산할 것으로 예상합니다. DLS는 163.2 nm의 평균 리포솜 직경과 -19.2 mV의 제타 전위를 나타냅니다(그림 1A). 극저온 전자 현미경(Cryo-EM) 이미징은 원형 리포솜을 보여주며(그림 1B), DLS 다이어그램은 평균 직경에서 상대적으로 작은 표준 편차를 보여줍니다(그림 1C).
양성 리포솜 결합에는 PBS 처리된 대조군이 필요합니다.
이 프로토콜을 사용하는 우리 그룹의 이전 연구에서는 생체 내 투여 1주 후 지방 SVF, 비장 및 혈액의 세포 하위 집합이 리포솜에 결합하는지 조사했습니다 3,4. PBS 처리된 마우스를 사용하여, 복강 및 비장 세포를 리포좀 처리된 마우스로부터의 샘플에 사용된 것과 동일한 항체 패널로 염색하였다. 처리 1주일 후에 조직을 채취하였다(도 2A). PBS 처리된 마우스의 샘플은 양성 DiD 게이트를 생성하는 DiD FMO 역할을 했습니다(그림 2B,C). DiD 양성 신호를 사용하여 포지티브 게이트를 생성할 수 있지만 DiD 신호가 없는 샘플은 양성 게이트에 DiD 음성이 포함되어 있지 않은지 확인하는 데에도 사용해야 합니다.
형광 신호를 최적화하기 위해 적정이 필요합니다
전체 실험을 실행하기 전에 세포 염색 중에 사용되는 형광 접합 항체의 농도 및 리포솜 준비 중에 사용되는 지질 염료의 농도를 포함한 다양한 조건을 최적화해야 합니다. 유세포 분석기는 형광 강도에 대한 검출 상한이 있으므로 리포솜에 너무 많은 염료가 포함되면 세포분석기를 통과하는 샘플에서 정량화할 수 없는 수준의 DiD 신호가 발생합니다. 또한 리포솜에 DiD가 너무 많으면 높은 수준의 비특이적 염료 전달이 발생하여 세포 흡수 결과가 왜곡될 수 있습니다. 그림 3은 사용된 유세포분석기의 검출 범위 내에서 최적의 신호를 생성할 수 있는 농도를 식별하기 위해 지질 염료의 농도를 적정한 실험의 결과를 보고합니다. 이것은 최종 실험을 위해 관심 조직인 혈액(그림 3A), 사타구니 지방 SVF(그림 3B) 및 부고환 지방 SVF(그림 3C)에 대해 수행되었습니다. 테스트를 위해 선택된 농도는 리포솜 1mL당 10mg의 DiD(높음, 빨간색), 1mg DiD(중간, 파란색) 또는 0.1mg의 DiD(낮음, 회색)였습니다. 리포솜에 사용된 최고 농도는 너무 높았고 세 조직 모두에서 세포분석기의 정량화 가능한 범위를 초과했습니다(그림 3A\u2012C, 빨간색). DiD의 가장 낮은 농도는 약간의 신호를 보였지만(그림 3 A\u2012C, 회색), PBS 처리된 세포(그림 3A\u2012C, 검은색)를 넘어서는 명확한 집단은 관찰되지 않았습니다. 정량화할 때 각 조직 및 농도에 대한 DiD MFI의 산술 평균은 PBS 대조군과 DiD 중간 농도 간의 명확한 차이를 보여주었습니다(그림 3D). 따라서 프로토콜에 표시된 대로 리포솜 준비에 사용할 중간 농도(그림 3, 파란색)를 선택했습니다.
다중 항체 패널을 사용하면 서로 다른 세포 하위 집합에 의한 리포솜 흡수를 식별할 수 있습니다
표 3에 요약된 패널을 사용하여, 세포를 대식세포, B 세포, T 세포, 수지상 세포, 단핵구 및 내피 세포에 대한 마커에 대한 항체로 염색하였다(도 4). 각 조직 유형에 대해 약간 다른 게이팅 전략이 필요하지만 각각에서 동일한 세포 유형의 대부분을 식별할 수 있습니다. 일부 예외에는 일반적으로 혈액에서 발견되지 않는 내피 세포와 일반적으로 다른 조직보다 혈액에서 더 높은 빈도를 갖는 단핵구가 포함됩니다. 집단이 식별되면 각 세포 집단의 총 크기와 DiD+ 빈도를 정량화할 수 있습니다. DiD+ 모집단을 특성화하기 위해 추가 계산을 수행할 수 있습니다: DiD+ 세포의 몇 퍼센트가 대식세포, 내피 세포 등인지. 이는 게이팅 전략의 예이지만 샘플을 분석하는 유일한 방법은 아닙니다. 분석은 선택한 패널과 사용 가능한 유세포 분석기에 의해 결정됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> 그림 1: 제조된 리포좀의 특성 예. (A) 크기 및 제타 전위는 전술한 바와 같이 측정되었으며, 표 형태로 보고되었다. 각 모수는 표준 편차± 평균으로 표시됩니다. (B) Cryo-EM을 사용하여 제조된 리포좀을 이미지화했습니다. 흰색 눈금 막대의 길이는 50nm입니다. (C) DLS는 이 프렙에서 리포솜의 직경의 히스토그램을 생성하는 데 사용되었습니다. 이 그림은 Osinski et al.3에서 발췌한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> 그림 2: PBS 또는 리포솜 처리된 마우스의 대표적인 DiD 염색. (A) PBS 및 리포솜 치료에 대한 실험적 개략도. PBS 또는 리포솜을 1주일 동안 3회 주사하였다. 조직은 치료 8일째에 적출하였다. (비, 씨) 대표적인 흐름 플롯은 리포솜 처리(C)에서 양성 DiD 염색을 나타내지만 PBS 처리(B) 마우스에서는 그렇지 않습니다. FSC, 전방 산란. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> 그림 3: 리포솜의 DiD 적정. 리포솜은 세 가지 다른 농도의 DiD로 준비되고 마우스에 주입되었습니다. 회색은 리포솜 1mL당 0.1mg DiD에서 낮은 농도를 나타내고, 파란색은 1mg DiD/mL 리포솜에서 중간 농도를 나타내며, 빨간색은 10mg DiD/mL 리포솜에서 높은 농도를 나타냅니다. PBS 처리된 마우스를 음성 대조군(검정색)으로 사용하였다. 혈액(A, 원), 사타구니 지방(B, 삼각형) 및 부고환 지방(C, 사각형)을 주사 후 24시간 후에 수확하고 처리하여 단세포 현탁액을 분리했습니다. 이 샘플은 유세포 분석기에서 검출 가능한 DiD 수준까지 실행되었습니다. 농도당 형광 강도(A\u2012C)를 입증하기 위해 각 처리 그룹의 오버레이가 있는 조직별 히스토그램이 제공됩니다. DiD의 산술 평균도 각 조직 및 농도에 대해 정량화하고 플롯팅했습니다(D). SSC = 측면 산란. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> 그림 4: 지방 SVF, 혈액 및 비장의 세포 하위 집합에 대한 대표적인 유세포 분석 분석. (A\u2012C) 지방 SVF(A), 비장(B) 및 혈액(C)에서 세포 하위 집합 및 DiD+ 세포를 식별하기 위한 게이팅 전략의 개략도를 나타냅니다. 약어: FSC = 전방 산란; LD = 살아있는/죽은; L-DCs = 림프성 수지상 세포; M-DCs = 골수 수지상 세포; SSC = 측면 산란. 이 그림은 Osinski et al.3에서 발췌한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>제어</td>
			<td>목적</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">PBS 또는 식염수로 치료한 마우스</td>
			<td>이 마우스의 세포를 사용하여 다음과 같은 유세포 분석 제어를 수행할 수 있습니다.</td>
		</tr><tr><td>1. 염색되지 않은 세포</td>
		</tr><tr><td>2. 살아있는/죽은 단일 얼룩</td>
		</tr><tr><td>3. 전체 패널로 염색되었지만 분석 중 리포솜 양성 신호를 결정하기 위한 리포솜 형광이 부족한 세포</td>
		</tr><tr><td>이 / 이 마우스 / 마우스는 실험에서 비 리포솜 대조군을 갖기 때문에 리포솜이 생체 내에서 어떤 영향을 미치는지 확인하는 데에도 사용됩니다.</td>
		</tr><tr><td>언로딩된 리포솜</td>
			<td>리포솜에 화합물을 로드하는 경우 리포솜 배치의 일부는 화합물 없이 합성되어야 합니다. 이것은 리포솜 단독의 생체 내 효과를 설명합니다.</td>
		</tr><tr><td>DiD 단독</td>
			<td>DiD는 또한 세포막에 의해 흡수 될 수 있기 때문에, 리포솜에서 발견되는 것과 동일한 양으로 유리 염료를 받기 위해 일부 마우스를 할당하면 배경 막 염색을 설명하는 데 도움이 될 것입니다.</td>
		</tr><tr><td>FMO(Fluorescence-minus-one) 제어</td>
			<td>이들은 패널에 있는 항체 중 하나를 제외한 모든 항체로 염색된 세포입니다. 위 상자의 #3과 마찬가지로 분석 중에 해당 항체에 대한 진양성 신호를 결정하는 데 도움이 됩니다</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 이 프로토콜에서 사용할 컨트롤
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>용액</td>
			<td>구성 요소</td>
			<td>배치/마우스당 필요한 대략적인 부피</td>
		</tr><tr><td colspan="3">리포솜 준비</td>
		</tr><tr><td>칼슘 아세테이트</td>
			<td>H2O중 1 M 칼슘 아세테이트</td>
			<td>50 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>hepes 버퍼</td>
			<td>H2O, pH 7.4에서 10 mM HEPES</td>
			<td>50 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>헤페스의 테사글리타자르</td>
			<td>10mM 헤페스에서</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">조직 채취, 가공 및 염색</td>
		</tr><tr><td>인산염 완충 용액(PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 중 증류된 H2O</td>
			<td>2 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>PBS-헤파린</td>
			<td>PBS의 0.1 mM 헤파린</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>hepes 버퍼</td>
			<td>PBS의 20mM HEPES</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>소화 완충액</td>
			<td>HEPES 완충액의 2mg/mL Collagenase Type I</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>AKC 용해 완충액</td>
			<td>ddH2O, pH 7.2에서 0.158 MNH3Cl, 10 mMKHCO3, 0.1 mMNa2EDTA</td>
			<td>15 mL의</td>
		</tr><tr><td>FACS 버퍼</td>
			<td>PBS에서 1% BSA, 0.05%NaN3</td>
			<td>15 mL의</td>
		</tr><tr><td>Fc 블록 (희석)</td>
			<td>FACS 버퍼의 1:50 Fc 블록</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>고정 버퍼</td>
			<td>PBS의 2% 파라포름알데히드</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 준비할 솔루션.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">세포외 염색(2x 항체 혼합물)</td>
		</tr><tr><td>항원</td>
			<td>형광단</td>
			<td>100 μL 시험당 Ab 부피</td>
			<td>필요한 총 볼륨:</td>
		</tr><tr><td>CD45 (CD45)</td>
			<td>퍼CP</td>
			<td>0.5 μL</td>
			<td>컬럼 C x 1.2 x 총 # 샘플</td>
		</tr><tr><td>CD11b입니다</td>
			<td>퍼씨프 Cy5.5</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>(0.5 μL/테스트) x (1.2) x (# 샘플)</td>
		</tr><tr><td>F4/80 키</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>(0.25 μL/테스트) x (1.2) x (# 샘플)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594〈화이트〉</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0.25 μL/테스트) x (1.2) x (# 샘플)</td>
		</tr><tr><td>CD3 (영어)</td>
			<td>핏</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1.0 μL/테스트) x (1.2) x (# 샘플)</td>
		</tr><tr><td>CD31 (영어)</td>
			<td>BV605 시리즈</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>등...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115 (CD115)</td>
			<td>체육</td>
			<td>1.5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">항체 혼합물을 만들려면 컬럼 D에서 계산된 항체를 FACS 버퍼 또는 브릴리언트 바이올렛 염색 버퍼*와 결합하여 최종 부피(50μL x 1.2 x 총 # 샘플)로 만듭니다.</td>
		</tr><tr><td colspan="4">라이브/데드 염색(1x)</td>
		</tr><tr><td>라이브/데드</td>
			<td>형광단</td>
			<td>200 uL 테스트 당 L / D 부피</td>
			<td>필요한 총 볼륨:</td>
		</tr><tr><td>라이브/데드</td>
			<td>아쿠아</td>
			<td>0.67 μL</td>
			<td>컬럼 C x 1.2 x 총 # 샘플</td>
		</tr><tr><td colspan="4">세포내 염색(1x)</td>
		</tr><tr><td>항원</td>
			<td>형광단</td>
			<td>50 μL 시험당 Ab 부피</td>
			<td>필요한 총 볼륨:</td>
		</tr><tr><td>αSMA (영문)</td>
			<td>핏</td>
			<td>0.125</td>
			<td>컬럼 C x 1.2 x 총 # 샘플</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*브릴리언트 바이올렛 염색 버퍼는 브릴리언트 바이올렛 형광단에 결합된 항체가 두 개 이상 패널에 사용되는 경우 사용해야 합니다.</td>
		</tr></tbody></table>표 3: 유동 염색에 사용할 염색 혼합물의 예시 및 항체 패널 계산.

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Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

이 프로토콜의 목표는 형광 표지된 리포솜을 합성하고 유세포 분석을 사용하여 세포 수준에서 리포솜의 생체 내 국소화를 식별하는 것입니다.

형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.1K 조회수.  University of Virginia. 이 프로토콜의 목표는 형광 표지된 리포솜을 합성하고 유세포 분석을 사용하여 세포 수준에서 리포솜의 생체 내 국소화를 식별하는 것입니다.

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

포괄적 인 절차를 평가하는<em&gt; 생체</em&gt; 암 나노 의학의 성능

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

연구

암 연구학

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

Vivo에서 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 형광 질 성 막 염료와 쥐 무릎 관절염 모델에서의 추적

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

발생학

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

생체공학

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.

관류의 공간 측정, 고체 종양에 삽입 유체 압력과 리포좀 축적

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and ...

의학

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

사용 하 여 체 외에서 전달 Chemotherapeutics 탐험 라이브 셀 이미징 지질 기반 나노 입자에 의해

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사를 사용하여 안구 약물 전달 시스템의 생체 내 측두 체 이미징

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 기관 이미징 및 정량 조직 조직학는 형광 표지 된 분자의 생물 분포를 확인하는 방법

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

생물학

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest in developing these peptides, especially cell-specific ones, as novel vectors for delivering diagnostic and therapeutic materials. Our past work involving phage display identified a novel, nonnaturally occurring, 12 amino acid-long peptide that we named cardiac targeting peptide (CTP) due to its ability to transduce normal heart tissue in vivo with peak uptake seen in as little as 15 min after an intravenous injection. We have undertaken detailed biodistribution studies by injecting CTP labeled with fluorophore cyanine5.5, allowing it to circulate for various periods of time, and euthanizing, fixing, and sectioning multiple organs followed by fluorescent microscopy imaging. In this publication, we describe these processes as well as ex vivo imaging of harvested organs using an in vivo imaging system in detail. We provide detailed methodologies and practices for undertaking transduction as well as biodistribution studies using CTP as an example.

We describe protocols for assessing the degree of transduction by cell-penetrating peptides utilizing ex vivo imaging systems followed by paraffin embedding, sectioning, and confocal fluorescent microscopy using cardiac targeting peptide as an example. In our protocol, a single animal can be used to acquire both types of imaging assessment of the same organs, thereby cutting the number of animals needed for studies by half.

심장 표적 펩타이드의 트랜스포션 효율성의 생체 내 이미징

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest ...

형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

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