Name: preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
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著者らは、フローサイトメトリーのトレーニングとサービスを提供してくれたMichael Solgaと他のフローサイトメトリーコアスタッフに感謝したいと思います。著者らはまた、シヴァ・サイ・クリシュナ・ダーサ、ダスティン・K・ボークナイト、メリッサ・A・マーシャル、ジェームズ・C・ガーメイ、シャンテル・マクスキミング、アディティ・ウパディエ、プラサド・スリカクラプのリポソーム調製(SSKD、DKB)、組織採取(MAM、JCG)、フローサイトメトリー染色とサンプル取得(AU、PS、CM)を支援してくれたことに感謝したい。この研究は、アストラゼネカ、R01HL 136098、R01HL 141123およびR01HL 148109、AHA 16PRE30770007、およびT32 HL007284助成金の支援を受けました。

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著者は開示するものは何もありません。

ここでは、(i)蛍光脂質色素で標識され、抗糖尿病化合物テサグリタザールを装填したリポソームを調製し、(ii)眼窩逆注射を介してマウスにリポソームを投与し、(iii)フローサイトメトリーによって細胞レベルでリポソームの取り込みを検出するための組織の採取、処理、および染色の3つの部分からなるプロトコルについて説明します。このプロトコルでは、約150μmのリポソームの調製と、脂肪、血液、および脾臓への取り込みの評価を確認します。リポソーム調製はスケーラブルで、主に室温で実行され、逆相蒸発を利用して薬物の負荷と有機溶媒の除去を最大化します。このプロトコルを使用すると、精製リポソームサンプルで最大2 mg/mLのテサグリタザール濃度を達成できます。調製したリポソームは、HEPESバッファーに4°Cで1年以上保存できます。私たちの経験では、彼らは平均粒子サイズの最小限の変動を示しました。薬物含量損失の10%未満は、10kDa遠心フィルターで外用薬物からリポソームを限外濾過分離した後、分光光度法で実証された。
リポソームの調製中、考慮すべきいくつかの重要なステップと要因があります。まず、プロトコルステップの順序は重要であり、遵守する必要があります。第二に、テサグリタザールの負荷時に使用される溶液のpHは、溶解度と効果的な負荷を最大化するために7.4に維持する必要があります。第三に、機器とフィルターを適切に組み立てることで、各ステップの出力が適切なサイズと純度になります。例えば、100 nmおよび200 nmのフィルターが適切に組み立てられていない場合、より不均一で不適切なサイズのリポソームのバッチが生じる可能性があります。第四に、リポソームへのテサグリタザールの移動を最大化するには、薬物ローディングの前に酢酸Caを完全に除去する必要があります。Ca-アセテートの完全な除去をテストするには、高速沈降を使用してリポソームを除去し、非リポソーム溶液中のCa-アセテートレベルを測定します。第五に、各ステップでリポソーム調製物に添加されたすべての材料の質量を秤量して記録することが重要です。これにより、適切な濃度が計算され、必要な材料の比率が維持されます。最後に、手法が適切に実行されない場合、望ましくないレベルの異質性が存在する可能性があります。DLSや電子顕微鏡などの他のアプローチを使用して、このパラメータを徹底的に確認することが重要です。均質性を向上させるには、選択したフィルターサイズを調整するか、2つのフィルターを積み重ねることを検討してください。
さらに、このプロトコルを完全に実施する前に、フローサイトメトリー用のコントロールと抗体パネルを計画および最適化することが重要です(表1、 表3)。抗体は、染色に適切な濃度が使用され、蛍光色素間のオーバーラップが最小限であることを確認するために試験する必要があります。リポソーム調製中に使用される色素の励起と放出も、パネル計画に考慮する必要があります。私たちの結果では、アロフィコシアニン(APC)やAlexaFluor 647などの蛍光色素と同様の励起と発光を持つDiDを利用しました。したがって、抗体パネルでは、これらの蛍光色素に結合した抗体を選択しませんでした。さらに、アイソタイプコントロールはこのプロトコルに含まれていません。これは、このプロトコル用に選択された抗体が十分に検証された市販の抗体であるためです。ただし、以前に最適化されていない抗体の使用に関心がある場合は、完全な実験を行う前に、目的の組織のアイソタイプコントロールに対して抗体をテストすることを検討してください。
このプロトコルは、マウスの後処理から血液、脾臓、鼠径脂肪、および精巣上体脂肪組織を抽出して処理する方法を示していますが、この一般的なアプローチは他の組織にも適用できます。目的の組織に応じて、次の組織について公開されているように処理および消化プロトコルを変更する必要がある場合があります:肺21、肝臓22、腹腔3、骨髄3,23、脳24。
考慮すべきこの方法の重要な制限は、摂取が動物ごとに1つの時点でしか評価できないことです。したがって、このプロトコルを他の非侵襲的イメージング技術と組み合わせるか、評価を実施するための十分なリソースを確保するためにそれに応じて計画することが有利な場合があります。リポソームは最初の24時間で全身を循環し、リポソームを取り込む細胞の寿命や取り込みに対する反応によっては、細胞死やさらなる食作用が起こる可能性があります。私たちの以前の研究は、異なる時点でのDiD+ 集団の集団特性の変化を示しました3。そのため、より早い時点または関心のあるメカニズムの生物学に最も関連する時点での取り込みを評価することが重要です。さらに、このプロトコルでは組織全体の細胞取り込みの定量化を行うことができますが、フローサイトメトリーでは組織の局在を明らかにすることはできません。このアプローチを組織学的手法と組み合わせると、この制限に対処するのに役立ちます。
一般に、このプロトコルは、組織学や全身蛍光イメージングなどの既存の方法論を補完します。フローサイトメトリーのツールと方法の継続的な進歩により、より多くの特異的な細胞集団に対するより大きなパネルの開発が可能になります。このプロトコルは、細胞取り込みの評価を改善し、フローサイトメトリーによって観察された結果を検証する機会も提供するため、前述の方法に加えて使用することを提案します。例えば、脂肪組織中の粒子の大部分がフローサイトメトリーによってマクロファージによって取り込まれたことがわかった場合。同じ脂肪組織の追加のアリコートの免疫蛍光を保存、固定、切片化、およびマクロファージマーカー用に染色して、細胞型が実際にリポソームを取り込むことを確認することができます。このアプローチは、実施されるナノ粒子生体分布アッセイに厳密さを追加するはずです:細胞特異的ターゲティングの検証、細胞取り込みの定量化、オフターゲット取り込みの特定、そしてうまくいけば、観察された治療結果のための機構的仮説を生成するための情報を提供します。このプロトコルは、さまざまなリポソームを使用した将来の研究、他の組織での取り込みの調査、肥満や代謝異常、またはナノ粒子送達が実行可能な治療オプションであるその他の疾患の設定における新しい化合物のテストにも適応できます。

ナノ粒子の薬物送達を利用する治療法の開発への関心が高まるにつれて、粒子の分布と取り込みを調製および評価する方法は、進歩し続け、拡大し、研究コミュニティが利用できるようにする必要があります1,2。このプロトコルは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)-α/γアゴニストであるテサグリタザールを装填したDiD標識リポソームによる治療後にin vivoでリポソームを取り込んだ正確な細胞型を評価するために開発されました3,4。これらの研究では、どの細胞型がリポソームテサグリタザール治療によって直接影響を受けたか、標的部分の有効性を評価し、観察された治療結果を説明する仮説を立てることができました。さらに、様々な細胞種において確立された生物学的機能は、マクロファージ、樹状細胞、および肝臓特異的クッパー細胞などの貪食細胞がリポソームの大部分を占めることを示唆している5,6,7。このプロトコルを利用して、非古典的食細胞もリポソームを取り込むことができることを実証しました3,4。
このプロトコルは、テサグリタザールの可溶化、逆相蒸発によるリポソームの調製、および遠隔薬物ローディングの誘引剤として酢酸カルシウムを使用するための最適化された方法を提示します。提示された方法は、多くのラボでアクセス可能であり、入手が困難な材料や高温を必要とするステップが不足しています。このプロトコルは、in vivo8での循環の増加に最適なサイズのリポソームを生成します。さらに、Suらによって要約されているように、今日まで、インビボリポソーム分布および組織取り込みを評価する方法が詳細に研究および試験されてきた9。陽電子放出断層撮影法(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)、および蛍光分子断層撮影法(FMT)法を適用して、組織特異的な生体分布と取り込みを定量化します9,10,11。これらの方法は、in vivoでの検出を最大化するように最適化されていますが、細胞分解能でin vivoでのリポソーム取り込みを定量化する能力はまだありません。ここで紹介するプロトコルは、フローサイトメトリーを使用してこのニーズを達成することを目的としています。最後に、このプロトコルでは、細胞の取り込みを脂肪組織を含むいくつかの組織に絞り込みました。肥満、代謝異常、および炎症の設定で治療を提供するためにナノ粒子を使用する可能性を調査した文献が増えています12、13、14、15、16、17。そのため、これらの病態に重要な役割を果たす組織の一つである脂肪組織を処理・分析するための効果的な方法を共有することが重要であると考えました。

<table><tbody><tr><td>1-mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10-mL syringe</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Clone AFS98</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Clone 1D3</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 FITC antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Clone 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Clone 390</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Desalting spin-column</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Zeba spin column</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering, Nicomp 370</td><td>Particle Sizing System, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX &amp;amp; PERM Cell Permeabilization Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Gauze sponges</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Liposome extruder</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic lubricant</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz Sterile</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene vial for mincing</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Heat therapy pump and pad</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Track-etched polycarbonate membranes</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS system</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes

特に標的治療アプローチのために、in vivoで化合物を送達するためにリポソームを使用することへの関心が高まっています。リポソーム製剤に応じて、リポソームは、体内の異なる細胞型によって優先的に取り込まれ得る。これは、さまざまな疾患の進行が組織および細胞型特異的であるため、治療粒子の有効性に影響を与える可能性があります。このプロトコールでは、DSPC、コレステロール、およびPEG-2000 DSPEと脂質色素DiDを蛍光標識として使用して、リポソームを合成および蛍光標識する方法の1つを紹介します。このプロトコルは、in vivoでリポソームを送達し、フローサイトメトリーを使用してリポソームの細胞特異的取り込みを評価するためのアプローチも提示します。このアプローチは、リポソームを取り込む細胞の種類を決定し、細胞型および組織にわたるリポソーム取り込みの分布および割合を定量化するために使用することができる。このプロトコルでは言及されていませんが、免疫蛍光やサイトメーターでのシングルセル蛍光イメージングなどの追加のアッセイは、細胞内染色の評価を可能にするため、得られた所見や結論を強化します。プロトコルは、目的の組織に応じて適合させる必要がある場合もあります。

リポソーム生産
ここで発表された結果は、以前に公開された研究3,4,20の結果と同様です。ここで提示したプロトコルを利用することで、約150〜160 nmのリポソームが作製できると期待しています。DLSは、163.2 nmの平均リポソーム直径と-19.2 mVのゼータ電位を明らかにします(図1A)。極低温電子顕微鏡(クライオEM)イメージングは円形リポソームを明らかにし(図1B)、DLS図は平均直径からの比較的小さな標準偏差を明らかにします(図1C)。
リポソーム結合の陽性にはPBS処理コントロールが必要
このプロトコルを採用した私たちのグループの以前の研究では、脂肪SVF、脾臓、および血液中のどの細胞サブセットがin vivo投与の1週間後にリポソームに結合したかを調査しました3,4。PBS処理マウスを用いて、腹腔および脾臓細胞を、リポソーム処理マウスからのサンプルに用いたのと同じ抗体パネルで染色した。組織は、1週間の処理後に採取した(図2A)。PBS処理マウスからのサンプルは、正のDiDゲートを作成するためのDiD FMOとして機能しました(図2B、C)。正のゲートはDiD陽性の信号を使用して作成できますが、DiD信号を欠くサンプルを使用して、正のゲートにDiD陰性のサンプルが含まれていないことを確認する必要もあります。
蛍光シグナルを最適化するには滴定が必要
完全な実験を実行する前に、細胞染色中に使用される蛍光標識抗体の濃度やリポソーム調製中に使用される脂質色素の濃度など、さまざまな条件を最適化する必要があります。フローサイトメーターは蛍光強度の検出に上限があるため、リポソームに組み込まれた色素が多すぎると、サイトメーターを通過するサンプルのDiDシグナルのレベルが定量化できなくなります。さらに、リポソーム内のDiDが多すぎると、高レベルの非特異的色素移動につながる可能性があり、細胞の取り込み結果が歪む可能性があります。図3は、使用したフローサイトメーターの検出範囲内で最適なシグナルを生成する濃度を特定するために脂質色素の濃度を滴定した実験の結果を報告しています。これは、最終実験の対象組織である血液(図3A)、鼠径脂肪SVF(図3B)、および精巣上体脂肪SVF(図3C)で実施されました。試験用に選択された濃度は、リポソーム1mLあたり10mgのDiD(高、赤)、1mgのDiD(中、青)、または0.1mgのDiD(低、灰色)であった。リポソームに使用された最高濃度は高すぎ、3つの組織すべてでサイトメーターの定量可能範囲を超えました(図3A\u2012C、赤)。DiDの最低濃度は何らかのシグナルを示したが(図3 A\u2012C、灰色)、PBS処理細胞(図3A-u2012C、黒)を超える明確な集団は観察されなかった。定量すると、各組織および濃度のDiD MFIの算術平均は、PBSコントロールとDiDの中間濃度との間の明確な区別を示した(図3D)。したがって、プロトコルに示されているように、リポソーム調製に使用する中間濃度(図3、青色)を選択しました。
多抗体パネルを使用することで、異なる細胞サブセットによるリポソーム取り込みの同定が可能
表3に概説したパネルを用いて、細胞を、マクロファージ、B細胞、T細胞、樹状細胞、単球、および内皮細胞に対するマーカーに対する抗体で染色した(図4)。組織タイプごとにわずかに異なるゲーティング戦略が必要ですが、同じ細胞タイプのほとんどをそれぞれで識別できます。いくつかの例外には、通常血液中に見られない内皮細胞、および通常他の組織よりも血中で高い頻度にある単球が含まれます。集団が特定されると、各細胞集団の合計サイズとそれらがDiD+である頻度を定量化できます。DiD+集団を特徴付けるために、さらなる計算を実行することができます:DiD+細胞の何パーセントがマクロファージ、内皮細胞などであるか。これらはゲーティング戦略の例ですが、サンプルを分析する唯一の方法ではないことに注意してください。分析は、選択したパネルと利用可能なフローサイトメーターによって決定されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> 図1:調製したリポソームの特性例。 (A)サイズとゼータ電位は上記のように測定され、表形式で報告されています。各パラメータは、平均±標準偏差として表されます。 (B) クライオEMを用いて調製したリポソームを画像化した。白いスケールバーの長さは50nmです。(c)DLSを用いて、この調製におけるリポソームの直径のヒストグラムを生成した。この図はOsinskiら3から改作されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> 図2:PBSまたはリポソーム処理マウスからの代表的なDiD染色。 (A)PBSおよびリポソーム処理の実験概略図。PBSまたはリポソームを1週間かけて3回注射した。組織は治療の8日目に採取された。(B、C)代表的なフロープロットは、リポソーム処理(C)マウスでは陽性のDiD染色を示していますが、PBS処理(B)マウスでは陽性ではありません。FSC、前方散乱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> 図3:リポソーム中のDiDの滴定。 3つの異なる濃度のDiDを用いてリポソームを調製し、マウスに注射した。灰色はリポソーム1 mLあたり0.1 mg DiDの低濃度を示し、青は1 mg DiD/mLリポソームの中間濃度を示し、赤は10 mg DiD/mLリポソームでの高濃度を示す。PBS処理マウスを陰性対照(黒)として用いた。血液(A、円)、鼠径脂肪(B、三角)、および精巣上体脂肪(C、四角)を注射後24時間で採取し、処理して単一細胞懸濁液を単離した。これらのサンプルを、検出可能なDiDのレベルまでフローサイトメーターで実行した。各治療群のオーバーレイを含む組織特異的ヒストグラムを提示して、濃度あたりの蛍光強度(A-u2012C)を示します。DiDの算術平均も組織及び濃度ごとに定量し、プロットした(D)。SSC = 側方散乱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> 図4:脂肪SVF、血液、および脾臓における細胞サブセットの代表的なフローサイトメトリー分析。 (A\u2012C)脂肪SVF(A)、脾臓(B)、および血液(C)中の細胞サブセットおよびDiD+細胞を同定するためのゲーティング戦略の概略表。略語:FSC =前方散乱;LD =生きている/死んでいる。L-DC =リンパ系樹状細胞;M-DC =骨髄性樹状細胞;SSC = 側方散乱。この図はOsinskiら3から改作されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>コントロール</td>
			<td>目的</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">PBSまたは生理食塩水で治療したマウス</td>
			<td>このマウスの細胞を以下のフローサイトメトリーコントロールに使用します。</td>
		</tr><tr><td>1. 染色されていない細胞</td>
		</tr><tr><td>2. 生きている/死んだ単一の汚れ</td>
		</tr><tr><td>3. フルパネルで染色されたが、分析中に陽性のリポソームシグナルを決定するためのリポソーム蛍光を欠いている細胞</td>
		</tr><tr><td>これ/これらのマウス/マウスは、実験で非リポソームコントロールがあるため、リポソームがin vivoで効果があるかどうかを判断するためにも使用されます。</td>
		</tr><tr><td>アンロードされたリポソーム</td>
			<td>リポソームに化合物を装填する場合は、リポソームバッチの一部を化合物なしで合成する必要があります。これは、リポソーム単独の任意のインビボ効果を説明する。</td>
		</tr><tr><td>DiD 単独</td>
			<td>DiDは細胞膜にも取り込まれる可能性があるため、一部のマウスにリポソームに見られる量と同じ量の遊離色素を投与するように割り当てると、バックグラウンド膜染色を説明するのに役立ちます。</td>
		</tr><tr><td>蛍光マイナス1(FMO)コントロール</td>
			<td>これらは、パネル内の1つを除くすべての抗体で染色された細胞です。上のボックスの#3と同様に、これは分析中にその抗体の真陽性シグナルを決定するのに役立ちます</td>
		</tr></tbody></table>表 1: このプロトコルで使用するコントロール。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>解決</td>
			<td>コンポーネント</td>
			<td>バッチ/マウスごとに必要なおおよその量</td>
		</tr><tr><td colspan="3">リポソーム製剤</td>
		</tr><tr><td>酢酸カルシウム</td>
			<td>H2O中の1 M酢酸カルシウム</td>
			<td>50ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ヘペスバッファー</td>
			<td>H 2 O、pH7.4中の10 mM HEPES</td>
			<td>50ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ヘペスのテサグリタザール</td>
			<td>10 mM ヘペスで</td>
			<td>10ミリリットル</td>
		</tr><tr><td colspan="3">組織の採取、処理、染色</td>
		</tr><tr><td>リン酸緩衝溶液(PBS)</td>
			<td>蒸留H2O中137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mMKH2PO4</td>
			<td>2ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>PBS-ヘパリン</td>
			<td>PBS中の0.1 mMヘパリン</td>
			<td>10ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ヘペスバッファー</td>
			<td>PBS中の20 mM HEPES</td>
			<td>5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>消化バッファー</td>
			<td>2 mg/mL コラゲナーゼ タイプ I (HEPES バッファー中)</td>
			<td>5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>AKC 溶解バッファー</td>
			<td>0.158 M NH 3 Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na 2 EDTA 中 ddH 2 O, pH7.2</td>
			<td>15ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>FACS バッファ</td>
			<td>PBS中の1%BSA、0.05%NaN3</td>
			<td>15ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>Fcブロック(希釈)</td>
			<td>FACS バッファ内の 1:50 Fc ブロック</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>固定バッファー</td>
			<td>PBS中の2%パラホルムアルデヒド</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>表2:準備するソリューション。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ある</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">細胞外染色(2x抗体ミックス)</td>
		</tr><tr><td>抗原</td>
			<td>フルオロフォア</td>
			<td>100 μLテストあたりのAb容量</td>
			<td>必要な総量:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>パーCP</td>
			<td>0.5 μL</td>
			<td>列 C x 1.2 x 合計 # サンプル数</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>パーCP Cy5.5</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>(0.5 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル)</td>
		</tr><tr><td>F4/80 キー</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>(0.25 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0.25 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1.0 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>等。。。</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>1.5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">抗体ミックスを作成するには、カラムDで計算した抗体をFACSバッファーまたはブリリアントバイオレット染色バッファー*と組み合わせて、最終容量(50 μL x 1.2 x 合計#サンプル)にします。</td>
		</tr><tr><td colspan="4">ライブ/デッド染色 (1x)</td>
		</tr><tr><td>ライブ/デッド</td>
			<td>フルオロフォア</td>
			<td>200 uLテストあたりのL / Dボリューム</td>
			<td>必要な総量:</td>
		</tr><tr><td>ライブ/デッド</td>
			<td>アクア</td>
			<td>0.67 μL</td>
			<td>列 C x 1.2 x 合計 # サンプル数</td>
		</tr><tr><td colspan="4">細胞内染色 (1x)</td>
		</tr><tr><td>抗原</td>
			<td>フルオロフォア</td>
			<td>50 μLテストあたりのAb容量</td>
			<td>必要な総量:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>0.125</td>
			<td>列 C x 1.2 x 合計 # サンプル数</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*ブリリアントバイオレット染色バッファーは、ブリリアントバイオレット蛍光色素に結合した複数の抗体をパネルで使用する場合に使用してください。</td>
		</tr></tbody></table>表3:フロー染色に使用する抗体パネルの例と染色ミックスの計算。

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Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

このプロトコルの目的は、蛍光標識されたリポソームを合成し、フローサイトメトリーを使用して細胞レベルでリポソームのin vivo局在を同定することです。

蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.2K ビュー.  University of Virginia. このプロトコルの目的は、蛍光標識されたリポソームを合成し、フローサイトメトリーを使用して細胞レベルでリポソームのin vivo局在を同定することです。

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

評価するための総合的な手順<em&gt;インビボ</em&gt;がんNanomedicinesのパフォーマンス

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

がん研究

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

生体内でひと脂肪由来間葉系幹細胞が脂溶性膜の蛍光色素をラット膝関節変形性関節症モデルでの追跡

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

発生生物学

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光<em&gt;インビボ</em&gt;光学イメージング

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

生物工学

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.

固形腫瘍内の灌流、間質液圧とリポソーム蓄積の空間測定

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and ...

医学

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

個々のリポソーム間の組成不均一性を検出するための定量的蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイ

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

体外配信生細胞イメージング化学療法を探求する脂質ナノ粒子によってを使用してください。

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

光ファイバー共焦点レーザー微小内視鏡検査を用いた眼内ドラッグデリバリーシステムの時空間的イン ビボ イメージング

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

の用法<em&gt; ex vivoで</em&gt;全体の臓器イメージングと定量的組織組織学は、蛍光標識分子のバイオ分布を決定します

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

生物学

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest in developing these peptides, especially cell-specific ones, as novel vectors for delivering diagnostic and therapeutic materials. Our past work involving phage display identified a novel, nonnaturally occurring, 12 amino acid-long peptide that we named cardiac targeting peptide (CTP) due to its ability to transduce normal heart tissue in vivo with peak uptake seen in as little as 15 min after an intravenous injection. We have undertaken detailed biodistribution studies by injecting CTP labeled with fluorophore cyanine5.5, allowing it to circulate for various periods of time, and euthanizing, fixing, and sectioning multiple organs followed by fluorescent microscopy imaging. In this publication, we describe these processes as well as ex vivo imaging of harvested organs using an in vivo imaging system in detail. We provide detailed methodologies and practices for undertaking transduction as well as biodistribution studies using CTP as an example.

We describe protocols for assessing the degree of transduction by cell-penetrating peptides utilizing ex vivo imaging systems followed by paraffin embedding, sectioning, and confocal fluorescent microscopy using cardiac targeting peptide as an example. In our protocol, a single animal can be used to acquire both types of imaging assessment of the same organs, thereby cutting the number of animals needed for studies by half.

心臓標的ペプチドの導入効率のインビボイメージング

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest ...

蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

要約

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この動画の章

評価するための総合的な手順

生体内でひと脂肪由来間葉系幹細胞が脂溶性膜の蛍光色素をラット膝関節変形性関節症モデルでの追跡

のためのツールとしてのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光

皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング

固形腫瘍内の灌流、間質液圧とリポソーム蓄積の空間測定

個々のリポソーム間の組成不均一性を検出するための定量的蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイ

体外配信生細胞イメージング化学療法を探求する脂質ナノ粒子によってを使用してください。

光ファイバー共焦点レーザー微小内視鏡検査を用いた眼内ドラッグデリバリーシステムの時空間的インビボイメージング

の用法

心臓標的ペプチドの導入効率のインビボイメージング

蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

要約

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評価するための総合的な手順

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