著者らは、フローサイトメトリーのトレーニングとサービスを提供してくれたMichael Solgaと他のフローサイトメトリーコアスタッフに感謝したいと思います。著者らはまた、シヴァ・サイ・クリシュナ・ダーサ、ダスティン・K・ボークナイト、メリッサ・A・マーシャル、ジェームズ・C・ガーメイ、シャンテル・マクスキミング、アディティ・ウパディエ、プラサド・スリカクラプのリポソーム調製(SSKD、DKB)、組織採取(MAM、JCG)、フローサイトメトリー染色とサンプル取得(AU、PS、CM)を支援してくれたことに感謝したい。この研究は、アストラゼネカ、R01HL 136098、R01HL 141123およびR01HL 148109、AHA 16PRE30770007、およびT32 HL007284助成金の支援を受けました。

<ol>
	<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+from+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 286 (2015).</li><li>Osinski, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liposomal+delivery+of+PPAR&#945;/&#947;+dual+agonist+tesaglitazar+in+a+model+of+obesity+enriches+macrophage+targeting+and+limits+liver+and+kidney+drug+effects.">In vivo liposomal delivery of PPAR&#945;/&#947; dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects.</a> Theranostics. 10 (2), (2020).</li><li>Bauknight, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+thorough+tissue+and+cellular+level+characterization+of+targeted+drugs+in+the+evaluation+of+pharmacodynamic+effects.">Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects.</a> PLoS ONE. 14 (11), (2019).</li><li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+A+Fundamental+Process+in+Immunity.">Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity.</a> BioMed Research International. , (2017).</li><li>He, H., Ghosh, S., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+dysfunctional+macrophage-associated+diseases.">Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases.</a> Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).</li><li>Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+and+the+mononuclear+phagocyte+system:+pharmacokinetics+and+applications+for+inflammatory+diseases.">Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases.</a> Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).</li><li>Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+liposome+size+on+the+circulation+time+and+intraorgan+distribution+of+amphipathic+poly(ethylene+glycol)-containing+liposomes.">Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes.</a> BBA - Biomembranes. , (1994).</li><li>Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+investigating+in+vivo+fate+of+nanoliposomes:+A+review.">Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).</li><li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole+body+biodistribution+of+fluorescent-labeled+agents+by+non-invasive+tomographic+imaging.">Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging.</a> PLoS One. 6 (6), 20594 (2011).</li><li>Larmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence-mediated+tomography+for+quantification+of+urokinase+receptor-dependent+leukocyte+trafficking+in+inflammation.">In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation.</a> Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).</li><li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clodronate+liposomes+improve+metabolic+profile+and+reduce+visceral+adipose+macrophage+content+in+diet-induced+obese+mice.">Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice.</a> PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).</li><li>Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+clodronate+liposomes+eliminates+visceral+adipose+macrophages+and+blocks+high-fat+diet-induced+weight+gain+and+development+of+insulin+resistance.">Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance.</a> The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).</li><li>Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-obesity+and+anti-inflammatory+effects+of+macrophage-targeted+interleukin-10-conjugated+liposomes+in+obese+mice.">Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice.</a> Biomaterials. 110, 81-88 (2016).</li><li>Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+an+active+and+passive+targeting+to+tumor+and+adipose+tissues.">Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).</li><li>Nakhlband, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combating+atherosclerosis+with+targeted+nanomedicines:+Recent+advances+and+future+prospective.">Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective.</a> BioImpacts. , (2018).</li><li>Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+targeted+nanotherapeutic+approach+for+obesity+treatment.">Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment.</a> International Journal of Nanomedicine. , (2018).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> Journal of Cell Biology. , (1986).</li><li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Use+of+Tail+Vein+Metastasis+Assays+and+Real-Time+In+Vivo+Imaging+to+Quantify+Breast+Cancer+Metastatic+Colonization+and+Burden+in+the+Lungs.">Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2019).</li><li>Dasa, S. S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plectin-targeted+liposomes+enhance+the+therapeutic+efficacy+of+a+PARP+inhibitor+in+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer.</a> Theranostics. , (2018).</li><li>Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-mediated+recruitment+of+NK+cells+is+a+critical+host+defense+mechanism+in+invasive+aspergillosis.">Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2003).</li><li>Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jir&#243;n Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestion+of+the+murine+liver+for+a+flow+cytometric+analysis+of+lymphatic+endothelial+cells.">Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e58621 (2019).</li><li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis.">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation research. , (2019).</li><li>O'Brien, C. A., Harris, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain.">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li></ol>

著者は開示するものは何もありません。

ここでは、(i)蛍光脂質色素で標識され、抗糖尿病化合物テサグリタザールを装填したリポソームを調製し、(ii)眼窩逆注射を介してマウスにリポソームを投与し、(iii)フローサイトメトリーによって細胞レベルでリポソームの取り込みを検出するための組織の採取、処理、および染色の3つの部分からなるプロトコルについて説明します。このプロトコルでは、約150μmのリポソームの調製と、脂肪、血液、および脾臓への取り込みの評価を確認します。リポソーム調製はスケーラブルで、主に室温で実行され、逆相蒸発を利用して薬物の負荷と有機溶媒の除去を最大化します。このプロトコルを使用すると、精製リポソームサンプルで最大2 mg/mLのテサグリタザール濃度を達成できます。調製したリポソームは、HEPESバッファーに4°Cで1年以上保存できます。私たちの経験では、彼らは平均粒子サイズの最小限の変動を示しました。薬物含量損失の10%未満は、10kDa遠心フィルターで外用薬物からリポソームを限外濾過分離した後、分光光度法で実証された。
リポソームの調製中、考慮すべきいくつかの重要なステップと要因があります。まず、プロトコルステップの順序は重要であり、遵守する必要があります。第二に、テサグリタザールの負荷時に使用される溶液のpHは、溶解度と効果的な負荷を最大化するために7.4に維持する必要があります。第三に、機器とフィルターを適切に組み立てることで、各ステップの出力が適切なサイズと純度になります。例えば、100 nmおよび200 nmのフィルターが適切に組み立てられていない場合、より不均一で不適切なサイズのリポソームのバッチが生じる可能性があります。第四に、リポソームへのテサグリタザールの移動を最大化するには、薬物ローディングの前に酢酸Caを完全に除去する必要があります。Ca-アセテートの完全な除去をテストするには、高速沈降を使用してリポソームを除去し、非リポソーム溶液中のCa-アセテートレベルを測定します。第五に、各ステップでリポソーム調製物に添加されたすべての材料の質量を秤量して記録することが重要です。これにより、適切な濃度が計算され、必要な材料の比率が維持されます。最後に、手法が適切に実行されない場合、望ましくないレベルの異質性が存在する可能性があります。DLSや電子顕微鏡などの他のアプローチを使用して、このパラメータを徹底的に確認することが重要です。均質性を向上させるには、選択したフィルターサイズを調整するか、2つのフィルターを積み重ねることを検討してください。
さらに、このプロトコルを完全に実施する前に、フローサイトメトリー用のコントロールと抗体パネルを計画および最適化することが重要です(表1、 表3)。抗体は、染色に適切な濃度が使用され、蛍光色素間のオーバーラップが最小限であることを確認するために試験する必要があります。リポソーム調製中に使用される色素の励起と放出も、パネル計画に考慮する必要があります。私たちの結果では、アロフィコシアニン(APC)やAlexaFluor 647などの蛍光色素と同様の励起と発光を持つDiDを利用しました。したがって、抗体パネルでは、これらの蛍光色素に結合した抗体を選択しませんでした。さらに、アイソタイプコントロールはこのプロトコルに含まれていません。これは、このプロトコル用に選択された抗体が十分に検証された市販の抗体であるためです。ただし、以前に最適化されていない抗体の使用に関心がある場合は、完全な実験を行う前に、目的の組織のアイソタイプコントロールに対して抗体をテストすることを検討してください。
このプロトコルは、マウスの後処理から血液、脾臓、鼠径脂肪、および精巣上体脂肪組織を抽出して処理する方法を示していますが、この一般的なアプローチは他の組織にも適用できます。目的の組織に応じて、次の組織について公開されているように処理および消化プロトコルを変更する必要がある場合があります:肺21、肝臓22、腹腔3、骨髄3,23、脳24。
考慮すべきこの方法の重要な制限は、摂取が動物ごとに1つの時点でしか評価できないことです。したがって、このプロトコルを他の非侵襲的イメージング技術と組み合わせるか、評価を実施するための十分なリソースを確保するためにそれに応じて計画することが有利な場合があります。リポソームは最初の24時間で全身を循環し、リポソームを取り込む細胞の寿命や取り込みに対する反応によっては、細胞死やさらなる食作用が起こる可能性があります。私たちの以前の研究は、異なる時点でのDiD+ 集団の集団特性の変化を示しました3。そのため、より早い時点または関心のあるメカニズムの生物学に最も関連する時点での取り込みを評価することが重要です。さらに、このプロトコルでは組織全体の細胞取り込みの定量化を行うことができますが、フローサイトメトリーでは組織の局在を明らかにすることはできません。このアプローチを組織学的手法と組み合わせると、この制限に対処するのに役立ちます。
一般に、このプロトコルは、組織学や全身蛍光イメージングなどの既存の方法論を補完します。フローサイトメトリーのツールと方法の継続的な進歩により、より多くの特異的な細胞集団に対するより大きなパネルの開発が可能になります。このプロトコルは、細胞取り込みの評価を改善し、フローサイトメトリーによって観察された結果を検証する機会も提供するため、前述の方法に加えて使用することを提案します。例えば、脂肪組織中の粒子の大部分がフローサイトメトリーによってマクロファージによって取り込まれたことがわかった場合。同じ脂肪組織の追加のアリコートの免疫蛍光を保存、固定、切片化、およびマクロファージマーカー用に染色して、細胞型が実際にリポソームを取り込むことを確認することができます。このアプローチは、実施されるナノ粒子生体分布アッセイに厳密さを追加するはずです:細胞特異的ターゲティングの検証、細胞取り込みの定量化、オフターゲット取り込みの特定、そしてうまくいけば、観察された治療結果のための機構的仮説を生成するための情報を提供します。このプロトコルは、さまざまなリポソームを使用した将来の研究、他の組織での取り込みの調査、肥満や代謝異常、またはナノ粒子送達が実行可能な治療オプションであるその他の疾患の設定における新しい化合物のテストにも適応できます。

ナノ粒子の薬物送達を利用する治療法の開発への関心が高まるにつれて、粒子の分布と取り込みを調製および評価する方法は、進歩し続け、拡大し、研究コミュニティが利用できるようにする必要があります1,2。このプロトコルは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)-α/γアゴニストであるテサグリタザールを装填したDiD標識リポソームによる治療後にin vivoでリポソームを取り込んだ正確な細胞型を評価するために開発されました3,4。これらの研究では、どの細胞型がリポソームテサグリタザール治療によって直接影響を受けたか、標的部分の有効性を評価し、観察された治療結果を説明する仮説を立てることができました。さらに、様々な細胞種において確立された生物学的機能は、マクロファージ、樹状細胞、および肝臓特異的クッパー細胞などの貪食細胞がリポソームの大部分を占めることを示唆している5,6,7。このプロトコルを利用して、非古典的食細胞もリポソームを取り込むことができることを実証しました3,4。
このプロトコルは、テサグリタザールの可溶化、逆相蒸発によるリポソームの調製、および遠隔薬物ローディングの誘引剤として酢酸カルシウムを使用するための最適化された方法を提示します。提示された方法は、多くのラボでアクセス可能であり、入手が困難な材料や高温を必要とするステップが不足しています。このプロトコルは、in vivo8での循環の増加に最適なサイズのリポソームを生成します。さらに、Suらによって要約されているように、今日まで、インビボリポソーム分布および組織取り込みを評価する方法が詳細に研究および試験されてきた9。陽電子放出断層撮影法(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)、および蛍光分子断層撮影法(FMT)法を適用して、組織特異的な生体分布と取り込みを定量化します9,10,11。これらの方法は、in vivoでの検出を最大化するように最適化されていますが、細胞分解能でin vivoでのリポソーム取り込みを定量化する能力はまだありません。ここで紹介するプロトコルは、フローサイトメトリーを使用してこのニーズを達成することを目的としています。最後に、このプロトコルでは、細胞の取り込みを脂肪組織を含むいくつかの組織に絞り込みました。肥満、代謝異常、および炎症の設定で治療を提供するためにナノ粒子を使用する可能性を調査した文献が増えています12、13、14、15、16、17。そのため、これらの病態に重要な役割を果たす組織の一つである脂肪組織を処理・分析するための効果的な方法を共有することが重要であると考えました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103251</td>
			<td>Clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-1152-82</td>
			<td>Clone AFS98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0114-82</td>
			<td>Clone N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD19 PE CF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562291</td>
			<td>Clone 1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3 FITC antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553061</td>
			<td>Clone 145-2C11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31 BV605</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102427</td>
			<td>Clone 390</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PerCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557235</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>700-107P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting spin-column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89889, 89890</td>
			<td>Zeba spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering, Nicomp 370</td>
			<td>Particle Sizing System, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIX &#38; PERM Cell Permeabilization Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>GAS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Dermacea</td>
			<td>441211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3393-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome extruder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z373400</td>
			<td>LiposoFast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Aqua</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic lubricant</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td></td>
			<td>20g/70 oz Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>433689L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene vial for mincing</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>Re111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Misonix</td>
			<td>XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T/Pump Heat therapy pump and pad</td>
			<td>Gaymer Industries</td>
			<td>TP-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tesaglitazar</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Track-etched polycarbonate membranes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1141Z**</td>
			<td>Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer/DLS-ELS system</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes

特に標的治療アプローチのために、in vivoで化合物を送達するためにリポソームを使用することへの関心が高まっています。リポソーム製剤に応じて、リポソームは、体内の異なる細胞型によって優先的に取り込まれ得る。これは、さまざまな疾患の進行が組織および細胞型特異的であるため、治療粒子の有効性に影響を与える可能性があります。このプロトコールでは、DSPC、コレステロール、およびPEG-2000 DSPEと脂質色素DiDを蛍光標識として使用して、リポソームを合成および蛍光標識する方法の1つを紹介します。このプロトコルは、in vivoでリポソームを送達し、フローサイトメトリーを使用してリポソームの細胞特異的取り込みを評価するためのアプローチも提示します。このアプローチは、リポソームを取り込む細胞の種類を決定し、細胞型および組織にわたるリポソーム取り込みの分布および割合を定量化するために使用することができる。このプロトコルでは言及されていませんが、免疫蛍光やサイトメーターでのシングルセル蛍光イメージングなどの追加のアッセイは、細胞内染色の評価を可能にするため、得られた所見や結論を強化します。プロトコルは、目的の組織に応じて適合させる必要がある場合もあります。

リポソーム生産
ここで発表された結果は、以前に公開された研究3,4,20の結果と同様です。ここで提示したプロトコルを利用することで、約150〜160 nmのリポソームが作製できると期待しています。DLSは、163.2 nmの平均リポソーム直径と-19.2 mVのゼータ電位を明らかにします(図1A)。極低温電子顕微鏡(クライオEM)イメージングは円形リポソームを明らかにし(図1B)、DLS図は平均直径からの比較的小さな標準偏差を明らかにします(図1C)。
リポソーム結合の陽性にはPBS処理コントロールが必要
このプロトコルを採用した私たちのグループの以前の研究では、脂肪SVF、脾臓、および血液中のどの細胞サブセットがin vivo投与の1週間後にリポソームに結合したかを調査しました3,4。PBS処理マウスを用いて、腹腔および脾臓細胞を、リポソーム処理マウスからのサンプルに用いたのと同じ抗体パネルで染色した。組織は、1週間の処理後に採取した(図2A)。PBS処理マウスからのサンプルは、正のDiDゲートを作成するためのDiD FMOとして機能しました(図2B、C)。正のゲートはDiD陽性の信号を使用して作成できますが、DiD信号を欠くサンプルを使用して、正のゲートにDiD陰性のサンプルが含まれていないことを確認する必要もあります。
蛍光シグナルを最適化するには滴定が必要
完全な実験を実行する前に、細胞染色中に使用される蛍光標識抗体の濃度やリポソーム調製中に使用される脂質色素の濃度など、さまざまな条件を最適化する必要があります。フローサイトメーターは蛍光強度の検出に上限があるため、リポソームに組み込まれた色素が多すぎると、サイトメーターを通過するサンプルのDiDシグナルのレベルが定量化できなくなります。さらに、リポソーム内のDiDが多すぎると、高レベルの非特異的色素移動につながる可能性があり、細胞の取り込み結果が歪む可能性があります。図3は、使用したフローサイトメーターの検出範囲内で最適なシグナルを生成する濃度を特定するために脂質色素の濃度を滴定した実験の結果を報告しています。これは、最終実験の対象組織である血液(図3A)、鼠径脂肪SVF(図3B)、および精巣上体脂肪SVF(図3C)で実施されました。試験用に選択された濃度は、リポソーム1mLあたり10mgのDiD(高、赤)、1mgのDiD(中、青)、または0.1mgのDiD(低、灰色)であった。リポソームに使用された最高濃度は高すぎ、3つの組織すべてでサイトメーターの定量可能範囲を超えました(図3A\u2012C、赤)。DiDの最低濃度は何らかのシグナルを示したが(図3 A\u2012C、灰色)、PBS処理細胞(図3A-u2012C、黒)を超える明確な集団は観察されなかった。定量すると、各組織および濃度のDiD MFIの算術平均は、PBSコントロールとDiDの中間濃度との間の明確な区別を示した(図3D)。したがって、プロトコルに示されているように、リポソーム調製に使用する中間濃度(図3、青色)を選択しました。
多抗体パネルを使用することで、異なる細胞サブセットによるリポソーム取り込みの同定が可能
表3に概説したパネルを用いて、細胞を、マクロファージ、B細胞、T細胞、樹状細胞、単球、および内皮細胞に対するマーカーに対する抗体で染色した(図4)。組織タイプごとにわずかに異なるゲーティング戦略が必要ですが、同じ細胞タイプのほとんどをそれぞれで識別できます。いくつかの例外には、通常血液中に見られない内皮細胞、および通常他の組織よりも血中で高い頻度にある単球が含まれます。集団が特定されると、各細胞集団の合計サイズとそれらがDiD+である頻度を定量化できます。DiD+集団を特徴付けるために、さらなる計算を実行することができます:DiD+細胞の何パーセントがマクロファージ、内皮細胞などであるか。これらはゲーティング戦略の例ですが、サンプルを分析する唯一の方法ではないことに注意してください。分析は、選択したパネルと利用可能なフローサイトメーターによって決定されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> 図1:調製したリポソームの特性例。 (A)サイズとゼータ電位は上記のように測定され、表形式で報告されています。各パラメータは、平均±標準偏差として表されます。 (B) クライオEMを用いて調製したリポソームを画像化した。白いスケールバーの長さは50nmです。(c)DLSを用いて、この調製におけるリポソームの直径のヒストグラムを生成した。この図はOsinskiら3から改作されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> 図2:PBSまたはリポソーム処理マウスからの代表的なDiD染色。 (A)PBSおよびリポソーム処理の実験概略図。PBSまたはリポソームを1週間かけて3回注射した。組織は治療の8日目に採取された。(B、C)代表的なフロープロットは、リポソーム処理(C)マウスでは陽性のDiD染色を示していますが、PBS処理(B)マウスでは陽性ではありません。FSC、前方散乱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> 図3:リポソーム中のDiDの滴定。 3つの異なる濃度のDiDを用いてリポソームを調製し、マウスに注射した。灰色はリポソーム1 mLあたり0.1 mg DiDの低濃度を示し、青は1 mg DiD/mLリポソームの中間濃度を示し、赤は10 mg DiD/mLリポソームでの高濃度を示す。PBS処理マウスを陰性対照(黒)として用いた。血液(A、円)、鼠径脂肪(B、三角)、および精巣上体脂肪(C、四角)を注射後24時間で採取し、処理して単一細胞懸濁液を単離した。これらのサンプルを、検出可能なDiDのレベルまでフローサイトメーターで実行した。各治療群のオーバーレイを含む組織特異的ヒストグラムを提示して、濃度あたりの蛍光強度(A-u2012C)を示します。DiDの算術平均も組織及び濃度ごとに定量し、プロットした(D)。SSC = 側方散乱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> 図4:脂肪SVF、血液、および脾臓における細胞サブセットの代表的なフローサイトメトリー分析。 (A\u2012C)脂肪SVF(A)、脾臓(B)、および血液(C)中の細胞サブセットおよびDiD+細胞を同定するためのゲーティング戦略の概略表。略語:FSC =前方散乱;LD =生きている/死んでいる。L-DC =リンパ系樹状細胞;M-DC =骨髄性樹状細胞;SSC = 側方散乱。この図はOsinskiら3から改作されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>コントロール</td>
			<td>目的</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">PBSまたは生理食塩水で治療したマウス</td>
			<td>このマウスの細胞を以下のフローサイトメトリーコントロールに使用します。</td>
		</tr><tr><td>1. 染色されていない細胞</td>
		</tr><tr><td>2. 生きている/死んだ単一の汚れ</td>
		</tr><tr><td>3. フルパネルで染色されたが、分析中に陽性のリポソームシグナルを決定するためのリポソーム蛍光を欠いている細胞</td>
		</tr><tr><td>これ/これらのマウス/マウスは、実験で非リポソームコントロールがあるため、リポソームがin vivoで効果があるかどうかを判断するためにも使用されます。</td>
		</tr><tr><td>アンロードされたリポソーム</td>
			<td>リポソームに化合物を装填する場合は、リポソームバッチの一部を化合物なしで合成する必要があります。これは、リポソーム単独の任意のインビボ効果を説明する。</td>
		</tr><tr><td>DiD 単独</td>
			<td>DiDは細胞膜にも取り込まれる可能性があるため、一部のマウスにリポソームに見られる量と同じ量の遊離色素を投与するように割り当てると、バックグラウンド膜染色を説明するのに役立ちます。</td>
		</tr><tr><td>蛍光マイナス1(FMO)コントロール</td>
			<td>これらは、パネル内の1つを除くすべての抗体で染色された細胞です。上のボックスの#3と同様に、これは分析中にその抗体の真陽性シグナルを決定するのに役立ちます</td>
		</tr></tbody></table>表 1: このプロトコルで使用するコントロール。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>解決</td>
			<td>コンポーネント</td>
			<td>バッチ/マウスごとに必要なおおよその量</td>
		</tr><tr><td colspan="3">リポソーム製剤</td>
		</tr><tr><td>酢酸カルシウム</td>
			<td>H2O中の1 M酢酸カルシウム</td>
			<td>50ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ヘペスバッファー</td>
			<td>H 2 O、pH7.4中の10 mM HEPES</td>
			<td>50ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ヘペスのテサグリタザール</td>
			<td>10 mM ヘペスで</td>
			<td>10ミリリットル</td>
		</tr><tr><td colspan="3">組織の採取、処理、染色</td>
		</tr><tr><td>リン酸緩衝溶液(PBS)</td>
			<td>蒸留H2O中137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mMKH2PO4</td>
			<td>2ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>PBS-ヘパリン</td>
			<td>PBS中の0.1 mMヘパリン</td>
			<td>10ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>ヘペスバッファー</td>
			<td>PBS中の20 mM HEPES</td>
			<td>5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>消化バッファー</td>
			<td>2 mg/mL コラゲナーゼ タイプ I (HEPES バッファー中)</td>
			<td>5ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>AKC 溶解バッファー</td>
			<td>0.158 M NH 3 Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na 2 EDTA 中 ddH 2 O, pH7.2</td>
			<td>15ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>FACS バッファ</td>
			<td>PBS中の1%BSA、0.05%NaN3</td>
			<td>15ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>Fcブロック(希釈)</td>
			<td>FACS バッファ内の 1:50 Fc ブロック</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>固定バッファー</td>
			<td>PBS中の2%パラホルムアルデヒド</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>表2:準備するソリューション。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ある</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">細胞外染色(2x抗体ミックス)</td>
		</tr><tr><td>抗原</td>
			<td>フルオロフォア</td>
			<td>100 μLテストあたりのAb容量</td>
			<td>必要な総量:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>パーCP</td>
			<td>0.5 μL</td>
			<td>列 C x 1.2 x 合計 # サンプル数</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>パーCP Cy5.5</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>(0.5 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル)</td>
		</tr><tr><td>F4/80 キー</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>(0.25 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0.25 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1.0 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>等。。。</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>1.5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">抗体ミックスを作成するには、カラムDで計算した抗体をFACSバッファーまたはブリリアントバイオレット染色バッファー*と組み合わせて、最終容量(50 μL x 1.2 x 合計#サンプル)にします。</td>
		</tr><tr><td colspan="4">ライブ/デッド染色 (1x)</td>
		</tr><tr><td>ライブ/デッド</td>
			<td>フルオロフォア</td>
			<td>200 uLテストあたりのL / Dボリューム</td>
			<td>必要な総量:</td>
		</tr><tr><td>ライブ/デッド</td>
			<td>アクア</td>
			<td>0.67 μL</td>
			<td>列 C x 1.2 x 合計 # サンプル数</td>
		</tr><tr><td colspan="4">細胞内染色 (1x)</td>
		</tr><tr><td>抗原</td>
			<td>フルオロフォア</td>
			<td>50 μLテストあたりのAb容量</td>
			<td>必要な総量:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>0.125</td>
			<td>列 C x 1.2 x 合計 # サンプル数</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*ブリリアントバイオレット染色バッファーは、ブリリアントバイオレット蛍光色素に結合した複数の抗体をパネルで使用する場合に使用してください。</td>
		</tr></tbody></table>表3:フロー染色に使用する抗体パネルの例と染色ミックスの計算。

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes at JoVE.com

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

このプロトコルの目的は、蛍光標識されたリポソームを合成し、フローサイトメトリーを使用して細胞レベルでリポソームのin vivo局在を同定することです。

蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K ビュー.  University of Virginia. このプロトコルの目的は、蛍光標識されたリポソームを合成し、フローサイトメトリーを使用して細胞レベルでリポソームのin vivo局在を同定することです。

ビデオ: Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

細胞収縮を定量化するための苦情の行列の準備

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

生物工学

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

ゴールドナノロッドを含む細胞車の作製と光音響分析

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

カチオン性およびアニオン性リポソームを用いてCNSへの治療用のsiRNAの送達

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

組織特異的細胞培養および配信プラットフォームとして、細胞外マトリックス由来のフォームおよびマイクロキャリアの作製

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

準備、精製、および脂肪酸含有リポソームを用いる

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

剛体の埋め込み固定し、ステンド グラス、全体、マイクロ コンピューター断層撮影によってセクション-無料の 3 D の組織学のためのミリ波スケール標本

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...