L’objectif global de ce protocole est de décrire les procédures impliquées dans l’établissement d’un modèle symptomatique et pharmacologique de souris pour la dystonie DYT/PARK-ATP1A3 en utilisant des canules cérébrales dans des pompes osmotiques et en induisant le stress par des tâches motrices difficiles. Cette méthode détaille comment établir un modèle pharmacologique de souris utilisant la livraison chronique de drogue par l’intermédiaire des pompes osmotic aux canules multiples de cerveau et comment induire le phénotype par des tâches motrices provocantes. Le paradigme du stress moteur léger donne également un aperçu du rôle des interactions gène-environnement dans les troubles du mouvement, et peut être appliqué à d’autres modèles de rongeurs.
Les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices nationales et institutionnelles applicables en matière de soins et d’utilisation des animaux. Commencez par préparer les pompes osmotiques dans un environnement stérile. Tout d’abord, remplissez une seringue d’un millilitre d’une canule de remplissage de calibre 27 avec une solution ouabain filtrée stérile ou une solution de véhicule.
Maintenez la pompe osmotique en position verticale, insérez la canule jusqu’à la pompe et remplissez lentement le réservoir jusqu’à ce qu’une solution excédentaire apparaisse sur le dessus. Ensuite, insérez le modérateur de flux dans la pompe. Enlever soigneusement la bride blanche du modérateur de flux avec des ciseaux et connecter un morceau de tube de vinyle au modérateur de flux.
Submergez chaque pompe dans des tubes Eppendorf remplis à mi-chemin de solution saline et mettez-les dans un thermocycler de 37 degrés afin de s’assurer que le taux de pompage atteint un état stable avant de commencer la chirurgie. Une fois que l’animal est profondément anesthésié selon les protocoles approuvés, placez l’animal dans un cadre stéréotaxique et fixez la tête à l’aide de pointes en caoutchouc ou de barres d’oreille non rompues. Après une désinfection complète de la zone chirurgicale, utiliser un scalpel pour placer l’incision au sommet de la tête et utiliser des ciseaux pour continuer l’incision jusqu’aux membres avant.
Exposez le crâne à l’aide de pinces à bouledogue et essuyez le périoste à l’aide d’un applicateur stérile à pointe de coton. Alignez soit un stylo ou la pointe d’un cannular taché d’encre noire avec du bregma et utilisez les coordonnées appropriées pour marquer les trois points d’entrée pour les canules cérébrales sur le crâne. Ensuite, percez soigneusement les trous pour le double cannular désigné pour les ganglions basiques et la canule unique désignée pour le cervelet.
Percer un quatrième trou pour une petite vis entre le striatum et le cervelet. Cette vis sera éventuellement intégrée dans le ciment dentaire et fournira une prise supplémentaire pour les cannulas. Afin de créer une petite poche pour la pompe osmotique de chaque côté des animaux en arrière, utilisez des forceps tissulaires pour séparer les couches de tissu sous-cutanées.
Avancez les forceps vers une jambe arrière et ouvrez légèrement les forceps afin d’élargir la poche sous-cutanée. Répétez la même procédure de l’autre côté, en enlevant d’abord les forceps de l’incision, puis en les poussant doucement vers la deuxième jambe arrière. À l’aide de forceps, insérez soigneusement les pompes et le cathéter connecté dans chaque poche sous-cutanée.
La poche doit permettre à la pompe de glisser facilement. À l’aide d’un mini support de pompe, introduire une seule canule osmotique d’une longueur personnalisée de 3,0 millimètres dans le trou foré dans la ligne médiane du cervelet. Détachez soigneusement la tête de canule et fixez la canule ainsi que la petite vis avec du ciment dentaire, en prenant soin de ne pas couvrir la pièce de raccordement pour le tube de la pompe osmotique.
Assurez-vous que le ciment dentaire entourant la canule a complètement séché avant de poursuivre la chirurgie. Avant d’insérer la double canule dans les trous forés bilatéralement au-dessus des ganglions basiques, attachez deux morceaux de tube de vinyle de 0,5 centimètre de long aux deux pièces de raccordement de la double canule. Connectez les tubes en vinyle avec un adaptateur de bifurcation et remplissez soigneusement l’ensemble du système de tubes avec une solution ou un véhicule stérile ou un véhicule.
Ensuite, répétez les mêmes étapes que précédemment pour la canule unique et terminez en fixant la double canule avec du ciment dentaire. Connectez les cathéters des pompes osmotiques à l’adaptateur de bifurcation ainsi qu’à une seule canule respectivement. Les deux pompes ont un débit égal alors faites attention à connecter la pompe osmotique avec une double solution concentrée à l’adaptateur de bifurcation pour s’assurer que la même concentration atteint à la fois les ganglions basiques et le cervelet.
Fermer l’incision sur le dos des animaux avec des points de suture dans la mesure du possible sans trop serrer la peau. Injecter subcutanément de la solution saline stérile, qui devrait avoir une température corporelle pour éviter la déshydratation. Retirez l’animal du cadre stéréotaxique et placez-le dans une cage de récupération.
Afin d’induire des mouvements dystoniques, les souris ouabain-perfusées devraient être exposées à des tâches motrices difficiles comme paradigme de stress doux quatre heures après la chirurgie et de façon répétitive toutes les 24 heures après. Cela n’inclut pas une caractérisation comportementale des animaux. Nous démontrons ici l’exemple d’un animal perfusé par véhicule, qui est placé sur un poteau en bois rugueux de surface de 50 centimètres, nez orienté vers le bas.
Fournir suffisamment de literie à la base du poteau en cas de chute. Pour les souris perfusées d’ouabain, les animaux devraient commencer à présenter les premiers symptômes comme la bradykinésie quatre heures après la chirurgie. Cependant, 24 heures après la chirurgie, vous devriez voir l’hyperextension involontaire des membres avant ou postérieur comme signe des mouvements dystonia-comme pendant la descente.
Les souris doivent descendre le pôle trois fois, permettre au moins deux minutes de récupération entre chaque descente. Le temps de descente n’a pas besoin d’être mesuré. Le test du poteau doit être suivi d’une deuxième tâche motrice, à l’aide d’une tige rotative.
Comme pour le test de performance Rotarod, les souris ouabain et perfusées par véhicule des groupes de stress sont placées sur la tige rotative. La latence à la baisse n’a pas besoin d’être mesurée. Comme pour le test précédent, les souris doivent être placées sur la tige rotative trois fois, ce qui permet deux minutes de récupération entre les courses.
L’échelle modifiée de notation de dystonie peut être employée pour évaluer la fréquence, la sévérité, et la distribution de corps des mouvements dystonia-comme des souris. Les animaux doivent être placés dans une boîte en plastique ou en bois et les mouvements doivent être enregistrés pendant une période de quatre minutes. Les tauxeurs doivent être aveuglés par l’affectation de groupe.
Les mouvements ou les postures qui sont considérés comme dystonie-like sont l’hyperextension involontaire des membres avant, une position large, ou hyperextension des membres postérieurs, aussi bien que la cyphose. Si une seule partie du corps est affectée, la dystonie doit être considérée comme focale. Si le tronc et au moins deux autres parties du corps sont affectés, la dystonie doit être considérée comme généralisée.
Un deuxième système de notation nouvellement développé de zéro à huit points, évalue la présence et la sévérité des mouvements dystonia-comme pendant un essai de suspension de queue. Pour le test, maintenez la souris près de sa base pendant deux minutes. Il est recommandé d’enregistrer le test de suspension de la queue et d’attribuer une note à l’analyse ultérieure de la séquence.
Les membres avant sont marqués de zéro à quatre points. Les rétractions toniques répétées ou soutenues de l’un des deux membres avant, aussi bien que l’hyperextension combinée avec le croisement des membres avant sont marqués comme dystonie-comme. Les mouvements dystoniques des membres postérieurs, c’est-à-dire la rétractation et le serrement, ainsi que l’hyperextension soutenue, sont marqués de zéro à trois points.
Une distorsion matraque présente plus de 80% du temps enregistré est notée avec un point supplémentaire. Le serrant de membre postérieur est signe non spécifique pour l’affaiblissement moteur et ne devrait pas être noté. Ce graphique montre les résultats de l’échelle d’évaluation de la dystonie.
Les souris stressées imprégnées d’ouabain présentent beaucoup plus de mouvements dystonia-like sur une période d’observation de 72 heures que le groupe ouabain-perfusé non-stress, aussi bien que les animaux de véhicule. Cette image représente les résultats du test de suspension de la queue et montre un résultat similaire à l’échelle d’évaluation de la dystonie. Notez que les résultats de la moyenne à partir du score total de chaque animal pour chaque point de temps.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’implanter stéréotaxiquement canules cérébrales multiples et comment implanter sous-cutanée pompes osmotiques. Le principal avantage de cette méthode est que les injections répétitives et stressantes peuvent être évitées et qu’un substrat comme l’ouabain, qui autrement aurait des effets secondaires à l’échelle du système peut être directement livré à une structure cérébrale spécifique.
