Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour échantillonner les sous-coucheurs de membrane périvitelline des oeufs aviaires pour une étude plus approfondie de leur rôle physiologique dans la reproduction des oiseaux. L’échantillonnage de la membrane périvitelline a été optimisé à chaque étape afin de limiter les dommages structurels et moléculaires. Le protocole a été développé pour la protéomique en profondeur.
Commencez par prél échantillonnage de la couche périvitelline ou PL à partir d’un œuf non fécondé fraîchement pondu. Casser l’œuf et utiliser un séparateur d’œufs pour séparer le jaune du blanc. Retirer le chalazae avec de petits ciseaux et rouler le jaune sur un papier filtre pour enlever l’albumine adhérente qui apparaît comme une structure transparente mais visible.
Immerger le jaune dans un cristallisateur contenant 10 millimlaires Tris HCL au pH huit qui a été préalablement refroidi à quatre degrés Celsius et enlever la zone PL sur le disque germinal dans une zone d’un centimètre à l’aide de ciseaux contondants. Rompre le PL avec de petits ciseaux à l’intérieur du tampon, puis tenir les deux bords du PL rompu avec des forceps et le peler du jaune. Rincez le PL plusieurs fois dans des bains de 10 millimolar Tris HCL jusqu’à ce qu’aucune trace de jaune ne soit visible.
Assurez-vous que le PL est propre, blanc et flottant dans le tampon. Traiter le PL pour la séparation des sous-couches ou procéder directement à des analyses biochimiques. Pour séparer la BPO et l’IPL, répartir l’échantillon entier avec la BPO face vers le haut dans une boîte en plastique de Petri remplie de 10 millimollar Tris HCL et chlorure de sodium de 50 millimlaires et le maintenir à plat avec le moins de rides possible.
Déterminer l’emplacement du chalazae restant qui n’est attaché qu’à la BPO. Ensuite, couper l’ensemble pl en morceaux d’environ deux par trois centimètres avec de petits ciseaux. Séparez mécaniquement les deux couches avec des forceps de pointe ultra précis sous un microscope disséquant.
Conservez les échantillons ipl et OPL qui en résultent individuellement dans des micro tubes à un taux négatif de 80 degrés Celsius jusqu’à nouvel usage. Pour effectuer la solubilisation primaire des protéines, congelez les échantillons de l’IPL et de la BPO individuellement pour enlever le reste de l’eau, puis coupez environ un milligramme de chaque échantillon et placez-le à l’intérieur d’un micro tube propre avec un bouchon à vis étanche. Gardez les échantillons restants dans des tubes bien fermés pour un stockage prolongé à 20 ou 80 degrés Celsius négatifs.
Mélanger un milligramme de chaque sous-couche lyophilisée avec 400 microlitres de Tris de 50 millimlaires au chlorure de sodium pH sept et 500 millimlaires. Utilisez un moulin à mélangeur deux fois pendant cinq minutes à 30 Hertz pour désintégrer les structures en microparticules et faciliter la solubilisation des protéines. Recueillir 400 microlitres des échantillons dans deux micro tubes propres.
Pour préparer les échantillons à l’électrophorèse, ajoutez un tampon d’échantillon SDS-PAGE 5X à chaque échantillon de 400 microlitres et chauffez-le à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. Chargez un maximum de 20 microgrammes de protéines dans chaque voie d’un gel polyacrylamide SDS de gradient de 4 à 20 % et effectuez l’électrophorèse à 120 volts. Après l’électrophoresis, retirer le gel des plaques de verre et le tacher avec coomassie brilliant blue solution pendant 30 minutes, puis de-tacher avec une solution composée de 50% d’eau, 40% d’éthanol et 10% d’acide acétique jusqu’à ce que le fond gel apparaît bleu clair.
Transférer le gel dans une boîte de Pétri contenant de l’eau déionisée pour la dé-coloration et la réhydratation. Les protéines doivent apparaître sous forme de bandes bleues avec un fond transparent. Le PL a été soumis à divers tampons pour identifier les conditions permettant une perte minimale de protéines et une séparation optimale des sous-couches.
Les protéines libérées à différentes concentrations de Tris, de pH et de chlorure de sodium sont présentées ici. Les deux sous-couchettes qui en ont résulté ont été observées au microscope disséquant. L’IPL est translucide tandis que la BPO est dense, nuageuse et blanchâtre.
Après la séparation, opl et IPL ont été lyophilisés indépendamment et leur teneur en protéine a été complètement dissoute utilisant une combinaison de broyage mécanique, d’un détergent anionique, d’un agent réducteur, et d’ébullition. Les échantillons présentaient des profils électrophorétiques distincts sur un gel polyacrylamide. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que la séparation des sous-coucheurs est une étape critique de la procédure et doit être effectuée à l’aide d’un microscope binoculaire dans un tampon contenant une concentration minimale de sel.
Pour élucider davantage leur fonction physiologique respective, les échantillons de sous-coucheur de membrane périvitelline peuvent être analysés pour la caractérisation histologique à l’aide de la microscopie électronique et pour des études fonctionnelles utilisant des analyses d’imagerie et la migration cellulaire.
