Nous tenons à remercier Susan Gerbi, Heidi Smith, et ​​David Lambert pour la fourniture du matériel à tester in vivo centrifugation sur Sciara coprophila et Ilyanassa obsoleta, respectivement. Nous remercions les membres du laboratoire de Welte pour les commentaires sur la technique et du manuscrit. Développement et le raffinement de l&#39;essai de centrifugation in vivo a été soutenue par NIGMS octroi GM64687 au MAE. Les images montrées dans la Fig. 1 et Fig. 5E, F 2 ont déjà été publiés et sont reproduits ici avec sa permission.

<ol>
	<li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot.">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li><li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+XXII:+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging.">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , (1927).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females.">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li></ol>

Les étapes critiques Assurez-vous que la concentration en gélose est suffisamment élevée. Si elle est trop faible, l&#39;agar-agar va se désintégrer pendant la centrifugation, et les embryons vont éclater ou être orientés de manière aléatoire. Si la concentration en gélose est légèrement trop faible ou si l&#39;agar-agar est humide (retrait insuffisamment séchés ou insuffisante du TSS en excès dans l&#39;étape 4.3), les embryons va flotter hors de leurs trous pendant la centrifugation et de devenir mal orientées. Si l&#39;agar-agar est versé trop mince, il sera également l&#39;effondrement ou du crack pendant la centrifugation. Assurez-vous que les embryons n&#39;ont pas avancé au-delà stades cellularisation. Sinon, la séparation des organites ne fonctionnera pas (Fig. 5C) depuis organites deviendra séquestrées dans des milliers de cellules individuelles. Chez les jeunes embryons au stade une cellule, les organites sont libres de migrer de grandes distances et s&#39;accumulent en fonction de leur densité caractéristique. Pour éviter d&#39;analyser les embryons qui sont trop vieux, assurez-vous de (i) comprennent une collection pré-pour permettre aux femelles de pondre des œufs anciens (étape 2.4), (ii) percevoir des embryons pour 3 heures ou moins (étape 2.5), (iii) sélectionner visuellement les embryons avant les étapes cellularisation pour s&#39;intégrer dans la gélose (étape 4.2), (iv) tenir intégrant peu de temps pour empêcher le développement jusqu&#39;à la fin de cellularisation (étape 4.6), et (v) de jeter les embryons qui n&#39;ont pas la couche correctement (étape 5.6) . Ne lésinez pas sur le temps de centrifugation. Bien que certains des embryons montrera superposition belle même après seulement 10 minutes de centrifugation, la séparation est incompatible de l&#39;embryon à l&#39;embryon. 30 tours min donnent des résultats très cohérents. En outre, plus le temps de centrifugation, le plus les couches sont stables après la centrifugation est terminée. Ceci est important pour les applications où il faut du temps pour traiter les autres embryons avant de les utiliser (par exemple, s&#39;ils ont besoin d&#39;être traitées pour des expériences de transplantation ou montés pour l&#39;analyse confocale). D&#39;éventuelles modifications Collecte des oeufs et de chorion retrait de nombreux protocoles différents existent pour les étapes 2 et 3 1, 3, 9, et fonctionne aussi bien que celles décrites ici aussi longtemps que les embryons utilisés sont des jeunes, le rendement d&#39;oeuf est élevé, et la fraction de mal embryons en scène est minimisé. Antéro-postérieure d&#39;alignement Le protocole oriente tous les embryons de telle sorte que l&#39;extrémité postérieure est enterré dans la gélose et l&#39;extrémité antérieure est en haut (fig. 3). Cette orientation est bonne pour la cohérence, de sorte qu&#39;il est possible d&#39;utiliser le micropyle comme un repère qui bout pointu pendant la centrifugation (Fig. 1, 5). Cependant, avec la pratique, il est facile de repérer l&#39;orientation des embryons centrifugé par l&#39;apparition distincte du lipide-goutte et les couches de jaune lumineux par microscopie à champ. Alors il devient possible de monter des embryons avec soit finissent; cette flexibilité accélère le processus de montage. Centrifugation non orientés L&#39;aspect le plus-de temps et techniquement difficiles de ce protocole est de fixation des embryons dans l&#39;agar (étape 4). Elle exige de toucher chaque embryon (une fois pour l&#39;insérer dans le trou et une fois de récupérer l&#39;après centrifugation). Comme alternative, on peut transférer des embryons à l&#39;étape 4.1 dans des microtubes rempli de TSS. Lorsque ces tubes sont centrifugés dans une microcentrifugeuse (13.000 rpm, 10-30 min), les embryons seront aussi généralement couche bien 10-13. Cette variation permet de traiter des centaines d&#39;embryons dans le même temps très rapidement. Cependant, la superposition n&#39;est pas aussi cohérente, une fraction des embryons ne se développent pas de couches distinctes, malgré les forces de centrifugation beaucoup plus élevé (~ 16 000 g) que appliquée dans le protocole précédent. Plus difficile est le fait que l&#39;orientation de l&#39;embryon est variable, et on peut observer une séparation à différents angles à l&#39;axe de l&#39;embryon majeur. Cette variabilité impose à l&#39;expérimentateur de trier après la centrifugation comment un embryon particulier a été organisé dans le tube à centrifuger. Avec l&#39;utilisation de l&#39;autofluorescence jaune comme un marqueur de la partie la plus dense de-l&#39;embryon, ce qui est souvent possible, mais il exige beaucoup de pratique et plus de jugement pour le faire de manière fiable. S&#39;il ya des embryons suffisamment dans l&#39;échantillon, on peut être capable de trier les cas où les embryons se trouvait être disposés comme dans la Fig. 1. La centrifugation des embryons dans leur coquille d&#39;œuf, il est possible d&#39;intégrer des embryons dans l&#39;agar pour l&#39;étape 4 sans avoir à retirer le chorion 2 premiers. Dans cette approche, les embryons sur la plaque de collecte sont couverts avec de l&#39;huile d&#39;halocarbures au lieu d&#39;eau de Javel à 50% à l&#39;étape 3.2 (halocarbures tourne le chorion translucide). Les embryons de stades appropriés sont sélectionnés et transférés à une plaque de gélose nouvelle aide de pinces; en saisissant uniquement les filaments d&#39;oeuf avec la pince à épiler, des dommages auxle bon embryon est évitée. Les embryons sont intégrées comme dans l&#39;étape 4.4 à 4.8, avec les filaments d&#39;oeuf antérieure collant vers le haut du trou dans la gélose. La coquille d&#39;œuf est éliminé par traitement javel 50% après les embryons ont été centrifugés et creusé de l&#39;agar comme à l&#39;étape 5.4. La centrifugation en présence de la coquille d&#39;oeuf peut améliorer le taux de devitellinization après fixation (étape 6.2), mais la sélection des étapes correctes pour la centrifugation (étape 4.2) est plus difficile. Applications Centrifugation embryon est particulièrement utile pour des expériences de colocalisation, soit pour tester si une protéine particulière se localise dans une certaine organite majeur. Par exemple, la protéine est présente sur Klar début gouttelettes lipidiques embryonnaire, pourtant, cette localisation est difficile à démontrer dans les embryons intacts. En partie, cela est parce que les deux points lacrymaux et Klar gouttelettes lipidiques sont abondants dans la périphérie 10 embryons, ce qui rend difficile de colocalisation fallacieuses exclure. Toutefois, la centrifugation concentre gouttelettes lipidiques dans une couche distincte, et donc, colocalisation avec signal Klar devient évident 10. Une analyse similaire a démontré sans équivoque la localisation d&#39;autres protéines à 8 gouttelettes lipidiques, 13-15, y compris des exemples surprenants, comme les histones certains 2 et dans les cas où une protéine est présente de façon ubiquitaire, mais enrichi sur 8 gouttelettes lipidiques. Comme les embryons peuvent être sélectionnées visuellement par le stade de développement (étape 4.2), il est même possible de détecter le recrutement régulés par le développement de protéines à 8 gouttelettes lipidiques, 15. Test de colocalisation avec des gouttelettes lipidiques est particulièrement facile puisque gouttelettes lipidiques s&#39;accumulent dans un visuellement distincte &quot;bouchon&quot;, donc pas de marqueur supplémentaires ou de la teinture est nécessaire pour identifier cette couche. En fait, en raison de sa facilité et potentiellement frappante résultats visuels (Fig. 1, Fig. 5 D, E), notre laboratoire utilise cette technique maintenant couramment comme un premier test si une protéine candidate est localisée à gouttelettes lipidiques. En principe, les études de colocalisation similaires devraient travailler pour le autres organites Fig. 1, et probablement pour d&#39;autres (y compris les parasites intracellulaires) dont la distribution dans les embryons centrifugé n&#39;a pas encore été documentée. Depuis centrifugation concentre organites en bandes serrées, il facilite l&#39;isolement d&#39;une fraction enrichie dans ces organites. Cette approche a déjà été utilisé pour récupérer des gouttelettes lipidiques pour la transplantation en 2 embryons donateurs. Il peut également être possible d&#39;analyser biochimiquement la fraction enrichie (par exemple, en coupant les couches hors embryons après fixation 15). La méthode décrite ici a des applications au-delà des embryons de drosophile, comme la centrifugation peuvent être utilisées pour stratifier les œufs de différentes espèces (y compris les grenouilles, les nématodes, les tuniciers, les annélides, les oursins, les mollusques, et les cnidaires) 16. Dans notre propre laboratoire, nous avons utilisé le protocole ci-dessus pour les embryons de la mouche domestique Musca domestica 2 et ont eu recours à la centrifugation non orientés dans l&#39;analyse des embryons de la coprophila sciarides Sciara 17 et l&#39;escargot Ilyanassa obsoleta 17. Enfin, cette méthode n&#39;est pas limitée aux embryons: Centrifugation peut également être utile pour stratifier les autres grandes cellules, telles que des ovocytes (par exemple, chez la drosophile 2, 18 et l&#39;asclépiade bug Oncopeltus fasciatus 17). Pour obtenir un spécimen différent, les conditions de centrifugation exactes doivent être optimisés: Par exemple, 10 minutes à 3000 g est suffisant pour stratifier efficacement embryons de Musca domestica 2, et si centrifugé beaucoup plus long, les embryons ont tendance à se briser lors de la fixation et immunocoloration.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60x15 mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>#35-1007</td>
<td>From Falcon</td>
</tr>
<tr>
<td>Wire mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150</td>
<td>stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Tungsten needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10130-10</td>
<td>0.25 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26016-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-100 or 59-101</td>
<td>For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively</td>
</tr>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8773</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in-vivo centrifugation of drosophila embryos

Une stratégie importante pour purifier et d&#39;isoler les différents types d&#39;organites intracellulaires est de les séparer les uns des autres en fonction des différences dans la densité de flottaison. Toutefois, lorsque les cellules sont perturbés avant la centrifugation, les protéines et les organites dans cet environnement non indigènes souvent de manière inappropriée coller les unes aux autres. Nous décrivons ici une méthode pour séparer par des organites de densité dans intactes, des embryons de drosophile vivant. Embryons précoces, avant cellularisation sont récoltés dans des cages de la population, et leurs coquilles d&#39;œuf extérieures sont éliminés par traitement à l&#39;eau de Javel à 50%. Les embryons sont ensuite transférés à une plaque de gélose de petites et insérées, extrémité postérieure d&#39;abord, dans de petits trous verticaux dans la gélose. Les plaques contenant des embryons incorporés sont centrifugés pendant 30 min à 3000g. L&#39;agar soutient les embryons et les maintient dans une orientation définie. Ensuite, les embryons sont creusés dans la gélose avec une aiguille émoussée. La centrifugation sépare organites majeurs en couches distinctes, une stratification facilement visible par microscopie à champ lumineux. Un certain nombre de marqueurs fluorescents sont disponibles pour confirmer la stratification succès dans les embryons vivants. Protéines associées à certains organites sera enrichie d&#39;une couche particulière, démontrant colocalisation. Couches individuelles peuvent être récupérées pour analyse biochimique ou transplantation dans des oeufs de donneur. Cette technique est applicable pour la séparation des organites dans d&#39;autres grandes cellules, y compris les œufs et les ovocytes d&#39;espèces diverses.

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In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Nous décrivons une méthode d&#39;organites séparés par la densité dans la vie<em&gt; Drosophile</em&gt; Embryons. Les embryons sont intégrés dans l&#39;agar et centrifugé. Cette technique donne une séparation reproductible des organites majeurs long de l&#39;axe antéro-postérieure d&#39;embryon. Cette méthode facilite les expériences de colocalisation et les rendements des fractions organite pour l&#39;analyse biochimique et des expériences de transplantation.

In vivo d&#39;embryons de drosophile Centrifugation

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

18.3K vues.  University of Rochester. Nous décrivons une méthode d'organites séparés par la densité dans la vie Drosophile Embryons. Les embryons sont intégrés dans l'agar et centrifugé. Cette technique donne une séparation reproductible des organites majeurs long de l'axe antéro-postérieure d'embryon. Cette méthode facilite les expériences de colocalisation et les rendements des fractions organite pour l'analyse biochimique et des expériences de transplantatio...