Ce travail est soutenu en partie par des fonds fournis par l&#39;Université de Caroline du Nord à Charlotte, Wachovia Fondation Caisse d&#39;excellence faculté, et une subvention de NIGMS (R15GM101571).

1. Préparation LSE <ol><li> Grenouilles femelles (Xenopus laevis) sont injectées deux fois pour la collecte des œufs. La première injection (amorçage) est de 100 U PMSG (gonadotrophine sérique de jument gravide) par grenouille. Grenouilles doit être amorcée au moins deux jours avant d&#39;œuf induisant la ponte et les grenouilles apprêtées sont utilisables jusqu&#39;à deux semaines. Pour les grenouilles premiers, injecter PMSG voie sous-cutanée dans les sacs lymphatiques dorsaux en utilisant une seringue de 3 ml et 27 G aiguille. </li><li> Pour induire la ponte, injecter 500 U hCG (gonadotrophine chorionique humaine) par voie sous-cutanée grenouille amorcée dans les sacs lymphatiques dorsaux aide d&#39;une aiguille 27 G. Incuber les grenouilles injectées dans des seaux séparés contenant 2 litres de solution 1x Marc modifié Ringer (ROR). Laissez les grenouilles 14-20 h à pondre avant la collecte. </li><li> Retirer les grenouilles des seaux et verser la solution ROR jusqu&#39;à environ 100 ml est à gauche. Obtenir des œufs des seaux en transférant les oeufs dans un bécher de 250 ml. </li><li> Dejelly oeufs en ajoutant 100 ml de cystéine 2% (réglagepH à 7,8 avec KOH 10 M). Remuer doucement les oeufs avec une pipette Pasteur en verre inversé (0,7 cm de diamètre) environ toutes les 30 secondes. Décanter et la remplacer par la cystéine frais deux fois pendant l&#39;incubation. Le processus dejellying est achevée en environ 5-15 minutes lorsque les oeufs former une couche plus dense au fond du bécher. </li><li> Jeter la solution de cystéine et de laver les oeufs trois fois avec MMR 0.25x. Swirl les oeufs dans la solution par une pipette de verre. &quot;Bad&quot; oeufs sont déterminées par une simple inspection visuelle et sont &quot;gonflés&quot; apparence blanche. Les «mauvaises» les œufs s&#39;accumulent au centre du bécher après agitation. Retirez les «mauvais» par les œufs d&#39;une pipette Pasteur. </li><li> Lavez les oeufs avec Lysis Buffer Egg (ELB) trois fois. Retirez tous les autres «mauvais» par les œufs d&#39;une pipette Pasteur. Verser les œufs dans un tube de 14 ml Falcon. </li><li> Faites tourner le tube Falcon de 55 sec à 188 xg (1100 rpm) selon la norme IEC CL2 clinique table centrifugeuse avec un rotor à godets oscillants pour compacter les œufs. Retirer l&#39;excès de tampon de lasupérieure de la couche d&#39;oeuf. Ajouter 0,5 ul d&#39;aprotinine / stock leupeptine et 0,5 l de bouillon cytochalasine B par ml d&#39;oeufs compactés. </li><li> Centrifuger à 16500 xg oeufs (10.000 rpm) pendant 15 min à 4 ° C en utilisant la RC6 Sorvall ainsi centrifugeuse superspeed avec HB6 rotor swing-out. Après centrifugation, les oeufs sont fractionnées en trois couches dans le tube: lipide, extrait, et le jaune / pigment de haut en bas, respectivement. Percer la paroi du tube Falcon dans la partie inférieure de la couche intermédiaire avec un extrait d&#39;aiguilles 21 G. Retirez délicatement l&#39;aiguille que l&#39;aiguille de ponction peut être obstrué par du plastique. Insérez une nouvelle aiguille 21 G montée sur une seringue de 1 ml dans le site de ponction pour recueillir l&#39;extrait. Aspirer lentement dans l&#39;extrait de seringue pour éviter les bulles d&#39;air et la contamination par le lipide et le jaune / pigment couches. </li><li> Placez les extraits dans une solution refroidie tube de 1,5 ml. Pour chaque millilitre d&#39;extrait d&#39;oeuf, ajouter les solutions suivantes stocks de produits chimiques dans l&#39;dicated concentration finale (indiquée entre parenthèses): (1) 10 ul cycloheximide (100 pg / ml); (2) 1 ul aprotinine / leupeptine (10 pg / ml); (3) 1 ul cytochalasine B (5 ug / ml ); (4) 1 Dithiothreitol ul (1 mM) et (5) 0,33 Nocodazole ul (3 pg / ml). Inverser l&#39;œuf extraire au moins 10 fois doucement. Il s&#39;agit de la LSE, qui doit être préparée et utilisée dans les 4 heures. La qualité de la LSE est compromise après 4 h ou de gel-dégel. </li></ol> 2. Traitement de la chromatine du sperme avec les approches endommageant l&#39;ADN <ol><li> Préparer la chromatine de sperme normale selon le procédé décrit précédemment 13. </li><li> Préparer la chromatine des spermatozoïdes MMS traité <ol><li> Reprendre la chromatine des spermatozoïdes normale dans 0,5 ml de tampon X. </li><li> Ajouter ~ 5,5 l de MMS (9,1 M en stock) à 500 ul resuspendues chromatine à une concentration finale de 100 mM. </li><li> Incuber la chromatine de sperme dans microtube à température ambiante pendant 30 min avec rotation. </li><li> Faites tourner la mTube icrocentrifuge à 686 xg (2100 rpm) pendant 10 min à température ambiante en utilisant la centrifugeuse IEC CL2 clinique avec rotor swing et adaptateurs pour tubes. </li><li> Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 0,5 ml de tampon BSA X plus (3%), TNT (0,1 mM) et aprotinine / leupeptine (10 pg / ml). </li><li> Répéter les étapes (4) et (5) deux fois pour laver la chromatine de sperme. </li><li> Déterminer la concentration de la chromatine des spermatozoïdes avec un hémocytomètre et diluer à 100.000 spermatozoïdes / ul. Économiser 5 aliquots à -80 ° C congélateur pour une utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Préparer la chromatine des spermatozoïdes traité contre les UV <ol><li> Ajouter la quantité désirée (par exemple 10 pi) de la chromatine des spermatozoïdes normale sur la surface d&#39;un morceau de parafilm. </li><li> Placez le Parafilm dans un agent de réticulation UV. Réglez le paramètre d&#39;énergie souhaité, en fonction de votre expérience, et de commencer à endommager la chromatine des spermatozoïdes par la lumière UV. Par exemple, il faut environ 21 secondes pour atteindre 1000 J / m 2. </li><li> Après UV irramédiation, la chromatine des spermatozoïdes traité contre les UV doivent être ajoutées aux extraits d&#39;œufs immédiatement. </li></ol></li></ol> 3. Préparation d&#39;un ADN dommages imitant la structure (AT70) <ol><li> Dissoudre deux oligonucléotides synthétiques poly-(dA) 70 (désigné A70) et le poly-(dT) 70 (désigné T70) dans de l&#39;eau à une concentration de 2 ug / ul, respectivement. </li><li> Ajouter 100 ul de A70 et 100 pi de T70 à un tube de 1,5 ml. Faire bouillir solution mixte synthétique oligo pendant 5 min à 95 ° C dans un heatblock. </li><li> Prenez le bloc bain sec sur (avec le tube contenant AT mélange dans celle-ci), et laissez-le refroidir à température ambiante sur une paillasse de laboratoire. Ce réglage de la température prend environ 45-60 min. </li><li> Le mélange refroidi est AT70 avec une concentration finale de 2 ug / ul. Magasin de 10 ul d&#39;aliquotes AT70 à -20 ° C congélateur pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 4. Déclenchement du Checkpoint dommages de l&#39;ADN dans la chromatine des spermatozoïdes avec LSE endommagé ou un DNA DamageStructure imitation- <ol><li> Provoquer le point de contrôle de dommages à l&#39;ADN dans la chromatine LSE sperme endommagé <ol><li> Ajouter 50 ul de la LSE à un tube de 1,5 ml et compléter avec 1 pl du mélange d&#39;énergie et de 2 pi de la chromatine des spermatozoïdes endommagés (concentration finale ~ 4,000 spermatozoïdes / réaction ul). </li><li> Incuber le tube de réaction à température ambiante pendant 90 min et feuilleter le tube toutes les 10 min. </li><li> Verser 1 pi de mélange réactionnel sur une lame de microscope supplémenté avec 1 ul de solution de colorant nucléaire après 30 min d&#39;incubation. Placer une lamelle couvre-objet sur le mélange de réaction et contrôler la formation de noyaux par l&#39;intermédiaire d&#39;un microscope à fluorescence. En règle générale, les noyaux ronde se former après 30 min d&#39;incubation, indiquant réplication de l&#39;ADN a initié. </li><li> Prenez 10 uL du mélange réactionnel dans 90 ul de tampon d&#39;échantillon. Les échantillons sont analysés par immunoblot en utilisant anti-Chk1 P-S344 ou anti-Chk1 anticorps. </li></ol></li><li> Provoquer le point de contrôle de dommages à l&#39;ADN dans le LSEAT70 <ol><li> Ajouter 50 ul de la LSE à un tube de 1,5 ml additionné de 1 ul du mélange d&#39;énergie et 1,6 ul de stock tautomycine. </li><li> Ajouter 1,25 ul de pré-faites AT70 (2 pg / pl) ou de l&#39;eau (comme témoin négatif) à chaque réaction. Incuber les réactions à la température ambiante pendant 90 min. Balayez les tubes de réaction toutes les 10 min. </li><li> Ajouter 10 ul du mélange réactionnel dans 90 ul de tampon d&#39;échantillon. Les échantillons sont examinés par immunoblot en utilisant anti-Chk1 P-S344 ou anti-Chk1 anticorps. </li></ol></li></ol> 5. Les résultats représentatifs La chromatine des spermatozoïdes endommagés ou endommagent l&#39;ADN imitant la structure peut déclencher le poste de contrôle ADN ATR/Chk1-mediated dommages dans le système de Xenopus extrait d&#39;oeuf. Montre la figure 2A que le MMS induit la phosphorylation de Chk1 à Ser344 (Chk1 P-S344), qui est un indicateur de activation de la kinase ATR. figure 2B montre que AT70, en tant que dommages de l&#39;ADN imitant structure, déclenche aussi la phosphorylation de Chk1. Total des échantillons Chk1 sont utilisés comme chargement des contrôles dans les deux exemples. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> Figure 1. Un schéma de la signalisation checkpoint dommages de l&#39;ADN. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> Figure 2. Chk1 phosphorylation est induite soit par MMS ou AT70 traitements dans des extraits d&#39;œufs de xénope. (A) le sperme endommagé par MMS chromatine (MMS) ou de la chromatine des spermatozoïdes normale (Con) sont incubés dans des extraits d&#39;œufs pendant 90 min. Chk1 phosphorylation sur Ser344 (Chk1 P-S344) et Chk1 totale dans les extraits d&#39;œufs sont examinés par immunoblot. (B) ou de l&#39;eau AT70 (Con) sont ajoutés dans des extraits d&#39;oeufs, respectivement. Les échantillons sont analysés par immunobuvardage aussi que dans (A).

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	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Il ya plusieurs avantages à étudier le point de contrôle de dommages à l&#39;ADN en utilisant Xenopus extraits d&#39;œufs. L&#39;utilisation d&#39;extraits d&#39;oeufs fournit une grande quantité d&#39;extraits exempts de cellules synchronisées en interphase du cycle cellulaire. Les extraits d&#39;oeufs peuvent être facilement et économiquement faite. Il est relativement facile à endommager l&#39;ADN ou de la chromatine et de révéler un défaut dans le poste de contrôle de dommages de l&#39;ADN apr...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactifs </td></tr><tr><td> Anti-Chk1 P-S344 anticorps </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> Chk1 anticorps anti- </td><td> Santa Cruz </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;aprotinine </td><td> MP Biomédical </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasine B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothréitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> Sigma </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-cystéine </td><td> Sigma </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptine </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> Méthyl méthanesulfonate (MMS) </td><td> Sigma </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> Sigma </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon d&#39;échantillon </td><td> Sigma </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycine </td><td> Wako Chemicals USA </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Seau pour la ponte </td><td> Rubbermaid Commercial Products </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 CEI centrifugeuse avec rotor à godets oscillants </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 rotor à godets oscillants </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6, plus centrifugeuse superspeed </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> Réticulation UV </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solutions </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaCl, 2 mM de KCl, 0,5 mM MgSO4, CaCl2 2,5 mM, HEPES 5 mM, ajuster le pH à 7,8 avec NaOH 10 M </td></tr><tr><td> L&#39;aprotinine / Leupeptine actions </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml dans de l&#39;eau. Stocker 20 aliquotes à -80 ° C. </td></tr><tr><td> X tampon </td><td></td><td></td><td> 0,2 M de saccharose, 80 mM de KCl, 15 mM de NaCl, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, HEPES 10 mM, ajuster le pH à 7,5 par HCl </td></tr><tr><td> Actions cycloheximide </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml dans de l&#39;eau. Boutique aliquotes de 1 ml à -20 ° C. </td></tr><tr><td> Cytochalasine B de stock </td><td></td><td></td><td> 5 mg / ml dans du DMSO. Stocker 20 aliquotes à -20 ° C. </td></tr><tr><td> Dithiothréitol (DTT) de bouillon </td><td></td><td></td><td> 1 M dans l&#39;eau. Boutique aliquotes de 1 ml à -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0,25 M de saccharose, 1 mM DTT, 50 pg / ml de cycloheximide, MgCl2 2,5 mM, KCl 50 mM, HEPES 10 mM, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole actions </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml dans du DMSO. Stocker 5 aliquotes à -80 ° C. </td></tr><tr><td> Mélange d&#39;énergie </td><td></td><td></td><td> 375 mM de phosphate de créatine, ATP 50 mM et 25 mM MgCl 2. Des aliquotes sont enregistrés à -80 ° C. </td></tr><tr><td> Solution de colorant nucléaire </td><td></td><td></td><td> 0,4 pg / ml de Hoechst 33258, le glycérol 25%(V / v), dans du PBS 1x </td></tr><tr><td> Actions tautomycine </td><td></td><td></td><td> 100 M dans le DMSO. Stocker 10 aliquotes à -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

Sur une base quotidienne, les cellules sont soumises à une variété d&#39;insultes endogènes et environnementaux. Pour lutter contre ces insultes, les cellules ont évolué checkpoint dommages à l&#39;ADN de signalisation comme un mécanisme de surveillance afin de détecter les dommages de l&#39;ADN et directs réponses cellulaires aux dommages à l&#39;ADN. Il ya plusieurs groupes de protéines appelés capteurs, transducteurs et des effecteurs impliqués dans la signalisation checkpoint dommages de l&#39;ADN (figure 1). Dans cette voie de signalisation complexe, ATR (ATM et Rad3 liée) est l&#39;un des principaux kinases qui peuvent répondre aux dommages à l&#39;ADN et le stress de réplication. Activé ATR peut phosphoryler ses substrats en aval tels que Chk1 (Checkpoint kinase 1). Par conséquent, phosphorylée et activée Chk1 conduit à de nombreux effets en aval sur le check-point dommages à l&#39;ADN, y compris l&#39;arrêt du cycle cellulaire, activation de la transcription, réparation de l&#39;ADN et l&#39;apoptose ou la sénescence (Figure 1). Lorsque l&#39;ADN est endommagé, ne pas activer les dommages à l&#39;ADN des résultats de points de contrôle dans unrepdommages aéré et, par la suite, l&#39;instabilité génomique. L&#39;étude du point de contrôle dommages à l&#39;ADN permettront d&#39;élucider comment les cellules de maintenir l&#39;intégrité du génome et de fournir une meilleure compréhension de la façon dont les maladies humaines telles que le cancer, se développer. Xenopus laevis extraits d&#39;œufs sont en train de devenir un puissant système acellulaire modèle extrait dans la recherche checkpoint dommages de l&#39;ADN. À basse vitesse extrait (LSE) a été initialement décrite par le groupe Masui 1. L&#39;ajout de la chromatine des spermatozoïdes demembranated aux résultats LSE dans la formation des noyaux où l&#39;ADN est répliqué de façon semiconservative une fois par cycle cellulaire. La voie de signalisation ATR/Chk1-mediated point de contrôle est déclenché par lésions de l&#39;ADN ou 2 stress réplicatif. Deux méthodes sont actuellement utilisées pour induire le point de contrôle de dommages à l&#39;ADN: approches endommageant l&#39;ADN et l&#39;ADN des dommages imitant les structures 3. Altération de l&#39;ADN peut être induite par les rayons ultraviolets (UV), γ-irradiation, méthyle méthaneesulfonate (MMS), la mitomycine C (MMC), 4-nitroquinoléine-1-oxyde (4-NQO), ou aphidicoline 3, 4. MMS est un agent alkylant qui inhibe la réplication de l&#39;ADN et active le point de contrôle des dommages l&#39;ADN ATR/Chk1-mediated 4-7. Irradiation UV déclenche également la 8 ADN ATR/Chk1-dependent dommages checkpoint. L&#39;ADN des dommages-imitant la structure AT70 est un complexe recuit de deux oligonucléotides poly-(dA) 70 et le poly-(dT) 70. Le système AT70 a été développé dans le laboratoire Bill Dunphy et est largement utilisé pour induire ATR/Chk1 signalisation aux points de contrôle 9-12. Ici, nous décrivons les protocoles (1) pour préparer des extraits d&#39;œufs exempts de cellules (LSE), (2) pour traiter la chromatine des spermatozoïdes de Xenopus avec deux ADN différents endommager les approches (MMS et UV), (3) pour préparer l&#39;ADN des dommages imitant la structure AT70, et (4) pour déclencher le point de contrôle des dommages dans l&#39;ADN ATR/Chk1-mediated LSE avec la chromatine de sperme endommagé ou un dommage d&#39;ADN-imitant la structure.

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus oeuf extrait est un système modèle utile pour étudier le point de contrôle de dommages à l&#39;ADN. Ce protocole est destiné à la préparation d&#39;extraits d&#39;œufs de xénope et de l&#39;ADN réactifs induisant des dommages aux points de contrôle. Ces techniques sont adaptables à une variété d&#39;approches endommageant l&#39;ADN dans l&#39;étude de la signalisation checkpoint dommages de l&#39;ADN.

Etude de l&#39;ADN à l&#39;aide de Checkpoint dommages<em&gt; Xenopus</emExtraits d&#39;oeufs&gt;

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

16.5K vues.  University of North Carolina at Charlotte. Xenopus oeuf extrait est un système modèle utile pour étudier le point de contrôle de dommages à l'ADN. Ce protocole est destiné à la préparation d'extraits d'œufs de xénope et de l'ADN réactifs induisant des dommages aux points de contrôle. Ces techniques sont adaptables à une variété d'approches endommageant l'ADN dans l'étude de la signalisation checkpoint dommages de l'ADN.

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Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Préparation et fractionnement de Xenopus laevis oeufs Extraits

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

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Biologie

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Assemblée nucléaire utilisant fractionnée extraits d&#39;œufs de Xénope

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Production d&#39;<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Œuf Extraits pour identifier les ARN associée aux microtubules

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Reconstitution de β-caténine dégradation dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrait des oeufs

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Détection et analyse de l&#39;ADN dommages souris muscle squelettique<em&gt; In Situ</em&gt; Utilisation de la méthode TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Un dosage cellulaire sans l&#39;aide<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extraits d&#39;étudier les mécanismes de règlement des tailles nucléaire

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.

Xenopus laevis Préparation d’extrait d’oeuf et méthodes d’imagerie en direct pour visualiser l’organisation cytoplasmique dynamique

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.

Démonstration du test de fibre d’ADN pour étudier les dommages à l’ADN et la dynamique de réparation induits par les nanoparticules

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Évaluation de l’interaction et de la localisation des protéines dans les dommages à l’ADN

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Combinaison du dosage du ligand de proximité avec la coloration Gamma-H2AX pour caractériser les interactions protéiques dans la réponse

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

Dosage des ligands de proximité pour localiser les protéines dans les sites de dommages à l’ADN

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...