Cette méthode convient à l’imagerie en direct de la dynamique cytoplasmique à l’aide d’extraits d’œufs de grenouille, permettant l’étude des informations de motif spatial dans le cytoplasme. Les échantillons peuvent être façonnés en une couche avec une épaisseur uniforme et réglable et imagés sur un champ 2D ou un volume 3D. Cette méthode est rentable et facile à mettre en œuvre.
Commencez par appliquer une couche de ruban adhésif FEP sur une lame de verre à l’aide d’un applicateur à rouleaux. Coupez le ruban adhésif excessif sur les bords avec une lame de rasoir propre. Ensuite, préparez les bordereaux de couverture enduits de ruban adhésif FEP de la même manière.
Appliquez ensuite une entretoise d’imagerie collante double face sur le côté enduit de ruban FEP de la glissière, en laissant la doublure de protection non pelée. Transférer les œufs dans un bécher en verre de 400 millilitres et enlever autant de tampon de ponte que possible en les décantant. Ensuite, incuber les œufs dans 100 millilitres de solution dégelante fraîchement préparée et les agiter doucement.
Après environ trois minutes, versez la solution et ajoutez 100 millilitres de solution de dégelage fraîche. Continuez l’incubation jusqu’à ce que les œufs soient bien emballés, mais évitez de laisser les œufs dans la solution de déjeltion pendant plus de cinq minutes au total. Après l’incubation, retirez la solution dégelante autant que possible et lavez les œufs dans un tampon ROR 0,25x.
Faites tourbillonner les œufs, puis versez le tampon. Répétez plusieurs fois jusqu’à ce qu’un litre total du tampon soit utilisé pour les lavages. Ensuite, lavez les œufs plusieurs fois avec un total de 400 millilitres de tampon de lyse des œufs, en éliminant les œufs anormaux entre les lavages.
Utilisez ensuite une pipette de transfert avec une pointe de coupe large pour transférer les œufs dans un tube centrifuge à fond rond de 17 millilitres contenant un millilitre de tampon de lyse des œufs. Faites tourner le tube dans une centrifugeuse clinique à 400 g pendant 15 secondes pour emballer les œufs. Ensuite, retirez autant de tampon de lyse de l’œuf que possible à l’aide d’une pipette Pasteur.
Déterminez le volume approximatif des œufs emballés. puis ajoutez cinq microgrammes par millilitre d’aprotinine, de leupeptine et de cytochalasine B et 50 microgrammes par millilitre de cyclohexamide directement sur les œufs emballés. Écraser les œufs en centrifuyant le tube pendant 15 minutes à 12 000 g et quatre degrés Celsius dans un rotor de godet oscillant.
Ensuite, fixez une aiguille de calibre 18 à une seringue. Avec le biseau de l’aiguille tourné vers le haut, percer le tube du côté au bas de la couche cytoplasmique et récupérer l’extrait en tirant lentement. Transférer l’extrait cytoplasmique récupéré dans un nouveau tube microcentrifuge et le garder sur la glace.
Lorsque vous êtes prêt à imager, complétez l’extrait avec les réactifs souhaités et les sondes d’imagerie par fluorescence. Retirez le revêtement protecteur supérieur de l’entretoise d’imagerie sur la lame préparée et déposez environ sept microlitres d’extrait au centre du puits. Appliquez immédiatement le couvercle enduit de ruban FEP avec le côté FEP face à l’extrait pour sceller le puits et procéder rapidement à l’imagerie.
Placez la lame sur un microscope inversé ou droit avec une platine motorisée et un appareil photo numérique. Imagez les extraits aux positions spatiales souhaitées à intervalles de temps dans les canaux de champ clair et de fluorescence. Une expérience time-lapse utilisant des extraits d’œufs de xenopus laevis pour étudier l’auto-organisation du cytoplasme pendant l’interphase est présentée ici.
Après environ 20 minutes d’incubation à température ambiante, des zones appauvries en composants cytoplasmiques diffusant la lumière étaient visibles dans les canaux de champ lumineux et les mitochondries. Environ 60 minutes à température ambiante, un schéma spatial constitué de compartiments en forme de cellules devrait être bien établi avec des microtubules formant une structure creuse en forme de couronne et des mitochondries clairement réparties dans chaque compartiment. Une comparaison des performances d’extraction dans les chambres d’imagerie avec et sans bandes FEP sur verre est présentée ici.
Dans la chambre en verre scotché FEP, l’extrait s’est auto-organisé en motifs cellulaires normaux. Dans la chambre où les surfaces de verre n’étaient pas recouvertes par le ruban FEP, l’extrait présentait des motifs anormaux de champ lumineux et de microtubules qui devenaient de plus en plus perturbés au fil du temps. Aucune différence significative n’a été observée dans l’importation nucléaire de la protéine GST-mCherry-NLS.
Les choses importantes à retenir sont de passiver les surfaces en verre avec du ruban FEP et d’enlever tous les mauvais œufs pendant la préparation de l’extrait. Avec ce système, nous pouvons facilement contrôler l’épaisseur de l’échantillon d’extrait, ouvrant la voie à l’imagerie des modèles cytoplasmiques en 3D, en utilisant la microscopie à feuille de lumière.
