Ces travaux ont été soutenus par des subventions de l’Académie de Finlande [315948, 314387 à N.K.]; Fondation Sigrid Jusélius [à N.K., J.T.]; Emil Aaltonen Foundation [à J.-A.M., T.L.]; Turku Doctoral Programme of Molecular Medicine [S.C.-M., O.O.].

L’entretien des souris de laboratoire et de toutes les expériences sur les animaux a été effectué conformément aux lignes directrices et règlements pertinents pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire à l’Université de Turku.
1. Préparation de tubules séminifères pour la microdissection
<ol><li>Sacrifier une souris mâle adulte (≥8 semaines, testis 80-120 mg selon la souche et l’âge) par asphyxie au CO2 suivie d’une dislocation cervicale. REMARQUE : La souris doit être mature sexuellement et de préférence d’au moins 8 semaines. Le modèle de transillumination des souris juvéniles diffère de l’adulte parce que l’onde de l’épithélium séminifique n’a pas encore été entièrement établie, et le moment de la première vague de spermatogenèse est distinct21,22. Le manque de spermatids allongés chez des souris mâles de 4 semaines empêche leur utilisation pour la microdissection assistée par transillumination. Toutes les souches de souris qui ont une spermatogenèse normale peuvent être utilisées.</li>
	<li>Vaporiser l’abdomen ventral de 70 % d’éthanol. Ouvrez la cavité abdominopelvienne à l’aide de ciseaux stériles, en faisant une ouverture en forme de V.</li>
	<li>Tirant sur le tampon de graisse épididymale avec des forceps stériles, localisez les testicules, disséquez-les à l’aide de ciseaux et placez-les sur une boîte de Pétri stérile de 100 mm contenant du PBS. REMARQUE : Pour maintenir la stérilité, assurez-vous que tous les outils de laboratoire et chirurgicaux sont stériles.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux à pointe fine décapsulent les testicules en coupant une fente dans le tunica albuginea,l’épaisse feuille fibreuse encapsulant les testicules. Puis déchirer la tunica ouverte à l’aide d’une paire de forceps. Forcer les tubules en appuyant avec des forceps et jeter la tunica. REMARQUE : Tout en jetant la tunica, il pourrait être avantageux pour certaines applications en aval que l’artéiculaire testiculaire soit enlevée avec la tunica. Évitez d’endommager les tubules séminifères.</li>
	<li>Déplacez les tubules séminifères dans une nouvelle boîte de Pétri et versez suffisamment de PBS stérile pour couvrir le fond de la boîte de Pétri. Ensuite, retirez doucement les tubules, mais évitez d’endommager les tubules. REMARQUE : Trop de stress mécanique emprisera le modèle de transillumination et affectera la viabilité du tissu et de son architecture cellulaire. Les tubules peuvent également être traités pour des immunostainings de montage entier à partir de ce point sans mise en scène (3B). Parfois, il suffit de définir la scène rétrospectivement en incluant des anticorps contre les protéines exprimées dans la différenciation spermatogonia, tels que SALL4, c-KIT et DNMT3A18,23. La densité du spermatogonia est un indicateur de stade relativement fiable (Figure 2).</li>
</ol>2. Microdissection assistée par transillumination
<ol><li>Placez fermement la boîte de Pétri sous un microscope à dissection en l’enlanant sur scène. REMARQUE : Il est important d’enregistrer bien la boîte de Pétri pour empêcher son mouvement qui pourrait causer le mélange des segments de tubule séminifères mis en scène rassemblés.</li>
	<li>Pour révéler le modèle d’absorption de la lumière des tubules séminifères sous mise au point, assurez-vous que l’échantillon est éclairé d’en bas et que la lumière traverse l’échantillon, c’est-à-direqu’il est transilluminé. REMARQUE : La quantité de lumière absorbée/dispersée est par rapport au niveau de condensation de chromatine dans les spermatids allongés et à leur regroupement à l’intérieur du tubule séminifère : plus il est condensé, plus la lumière est absorbée, c’est-à-dire qu’elleapparaît plus foncée.</li>
	<li>Familiarisez-vous avec le modèle d’absorption de la lumière des différentes étapes tel que décrit dans la figure 2, la figure 5A et la figure S1 en déplaçant soigneusement des faisceaux de tubules à l’aide de forceps fins. REMARQUE : Les étapes se suivent toujours dans un ordre logique, formant la vague de l’épithélium séminifère. Cependant, il est important de savoir que la direction de l’onde spermatogénique s’inverse parfois, puis revient à nouveau (également connu sous le nom de modulations4,9), compliquant parfois la procédure. En outre, la longueur de chaque étape, en termes de combien de mm de tubule, varie considérablement.</li>
	<li>Soulevez soigneusement le tubule d’intérêt à l’aide de forceps avec une pointe accrochée, puis coupez un segment de longueur appropriée à l’aide de ciseaux de microdissection (voir vidéo supplémentaire 1). Un crochet à l’extrémité des forceps facilite le levage et la tenue d’un tubule et aide à éviter de le presser. REMARQUE : La longueur des segments à couper dépend des applications en aval. Pour la collecte de morceaux de tubule mis en commun d’une étape spécifique pour l’analyse des protéines ou del’ARN 12,13 (II-V, VII-VIII et IX-XI, figure 5B),la longueur est généralement de 2-5 mm. Lorsque l’extraction standard phénol-chloroforme est utilisée, environ 200 ng d’ARN peuvent être dérivés de 1 mm de tubule. Pour la coloration de montage entier des segments de tubule mis en scène, la longueur des segments devrait être >5 mm. Pour les préparations de courge, la longueur des segments ne doit pas dépasser 1 à 2 mm parce que les cellules au milieu du segment peuvent ne pas sortir si elles sont trop longues. Utilisez une échelle de mm sous la boîte de Pétri pour une mesure précise de la longueur du tubule.</li>
</ol>3. Immunostaining de différentes préparations
<ol><li>Préparation de courge : vérification de stade et immunostaining REMARQUE : Des morceaux de tubule spécifiques à l’étape peuvent être écrasés sur une lame de microscope avec un verre de couverture pour effectuer l’analyse morphologique des cellules vivantes par microscopie de phase-contraste et immunostaining suivant. Un débutant est recommandé d’utiliser cette approche pour vérifier les étapes lors de la connaissance de la méthode de microdissection assistée par transillumination.<ol>
<li>Recueillir le segment dans un volume de 10 μL à l’aide d’une pipette et le déplacer sur une lame de microscope.</li>
		<li>Écraser le tubule en plaçant soigneusement un verre de couverture (20 mm x 20 mm) sur le tubule. En conséquence, les cellules s’écoulent du tubule et forment un monocouche à cellules vivantes. Placez un papier filtre sur le bord du verre de couverture pour faciliter la propagation des cellules. Évitez trop d’écraser les cellules pour les garder en vie.</li>
		<li>Surveiller la propagation des cellules au microscope. Utilisez un microscope à contraste de phase à l’objectif 40x pour vérifier la reconnaissance par étapes en examinant les types de cellules présents (figure 2, figure S2).</li>
		<li>Une fois que les cellules se sont propagées pour former un monomouche rond des deux extrémités du tubule, trempez la glissière dans un récipient contenant de l’azote liquide tout en la tenant avec des forceps. Gardez-le immergé pendant 10 s. Placez alternativement la glissade sur une plaque de glace sèche pour le gel.</li>
		<li>Retirer le verre de couverture en le renversant à l’aide d’un scalpel.</li>
		<li>Sans délai, procéder à la fixation et placer rapidement la glissière dans un récipient avec 90% d’éthanol pendant 2-5 min. REMARQUE : Assurez-vous que la préparation de la courge ne dégèle pas avant de la placer à 90 % d’éthanol. D’autres fixatifs peuvent également être utilisés, comme l’acétone, pendant 10 min.</li>
		<li>Sécher à l’air et les conserver à température ambiante (RT) (jusqu’à quelques jours) ou à -80 °C (à long terme).</li>
		<li>Pour l’immunostaining, post-fixer les échantillons dans 4% paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 min à RT.</li>
		<li>Rincer en PBS et perméabilizer avec 0,1% Triton X-100 en PBS pendant 5 min.</li>
		<li>Rincer au PBS et dessiner un anneau de graisse autour de chaque échantillon de courge.</li>
		<li>Ajouter 50 à 100 μL de 10 % de BSA (albumine de sérum bovin) dans 0,1 % de préadolescent dans le PBS (PBST) à l’intérieur de l’anneau de graisse et bloquer les échantillons pendant 30 min à RT.</li>
		<li>Retirez la solution BSA et incubez avec un anticorps primaire dilué dans 10% BSA en PBST pendant 1 h à RT.</li>
		<li>Laver 3x pendant 5 min avec PBST.</li>
		<li>Incuber avec un anticorps secondaire dilué dans 10% BSA en PBST. REMARQUE : Pour tacher les acrosomes, les échantillons peuvent être incubés avec de l’anticorps agglutinine d’arachide étiqueté rhodamine (PNA, 1:1000) dans 10% BSA en PBST pendant 1 h à RT (figure S3) au lieu d’anticorps primaires et secondaires spécifiques.</li>
		<li>Laver 3x pendant 5 min chacun avec PBST, rincer avec PBS et monter avec un support contenant DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunostaining de montage entier des tubules seminifères REMARQUE : Le protocole ci-dessous décrit la coloration de montage entier pour les segments de tubules mis en scène (à partir de l’étape 2.4). Si un chercheur veut effectuer des taches de montage entier sans mise en scène (à partir de l’étape 1.5), faites attention aux notes en 3.2.1 et 3.2.7.<ol>
<li>À l’aide d’une pipette, transférer les segments tubules (de l’étape 2.4) dans un PBS glacé dans un tube conique de 15 mL et leur permettre de sédimenter sur la glace. REMARQUE : Si vous utilisez des tubules non mis en scène à partir de 1,5,, séparez les tubules dans une boîte de Pétri en érigés de haut en arrière sur un plat incliné plusieurs fois. Utilisez une pipette de 1 mL avec une pointe coupée. Cette étape vise à ouvrir la structure du tissu. Cependant, évitez trop de pipetage car il pourrait endommager les tubules. La sédimentation des tubules prendra quelques dizaines de secondes. De petits fragments de tubules, des cellules interstitielles et des débris cellulaires restent dans le supernatant.</li>
		<li>Retirez soigneusement le supernatant (SN) par pipetting ou avec un aspirateur. Ajouter 10 mL de PBS glacé et mélanger par inversion.</li>
		<li>Laisser sédimenter, puis enlever le SN comme avant.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de 4% de PFA et fixer pendant 5 h sur une table rotative (20-30 rpm) à +4 °C. REMARQUE : Le temps de fixation dépend des protéines d’intérêt et de leur localisation subcellulaire. Pour les protéines nucléaires et cytoplasmiques, une fixation de 2 h est généralement suffisante, cependant, des marqueurs membranaires, tels que GFRα1 (récepteur familial GDNF alpha 1; Figure 6A,B), bénéficier d’une fixation plus longue, jusqu’à 6 h.</li>
		<li>Laisser sédimenter, enlever le SN (PFA) comme avant, et rincer brièvement en ajoutant 10 mL de PBS et en inversant le tube.</li>
		<li>Laisser sédimenter, enlever le SN comme avant, et répéter l’étape de lavage PBS trois fois pendant au moins 10 min chacun sur une table rotative à +4 °C et procéder à la coloration ou le stocker à +4 °C. REMARQUE : Si les conditions de travail sont stériles et propres, les échantillons peuvent être stockés et utilisés pendant au moins quelques semaines. Sinon, ajoutez de l’azide de sodium à une concentration finale de 0,02 % (w/v) à partir d’une solution de stock de 2 % pour aider à préserver les tubules avant de les stocker à +4 °C.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette de 1 mL, déplacez 10 à 20 segments de tubules fixes vers un tube à fond rond de 2 mL. Laisser sédimenter et enlever le SN. REMARQUE : Si vous travaillez avec de longs tubules qui n’ont pas été mis en scène, versez les tubules sur une boîte de Pétri et à l’aide de ciseaux de microdissection et de forceps coupent des segments d’environ 5 à 20 mm. Les segments trop longs s’emmêlent pendant la procédure de coloration, tandis que les segments trop courts sont facilement perdus.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de 2% BSA + 10% FBS (sérum bovin fœtal) dans 0,3% Triton X-100 en PBS (PBSX). Bloquez pendant au moins 1 h sur une table rotative (20-30 tr/min) à RT.</li>
		<li>Rincer avec 1 mL de PBSX, retirer le SN par pipetting et ajouter 250 μL d’anticorps primaires dilués dans 1% BSA dans PBSX (1:100-1:2000 dilution). Incuber pendant 2 h à RT ou toute la nuit à +4 °C sur une table rotative (20-30 tr/min).</li>
		<li>Retirez la solution d’anticorps en pipetage et rincez les tubules avec 1 mL de PBSX comme ci-dessus. Laver trois fois pendant 1 h en PBSX sur une table rotative (20-30 tr/min) à RT. REMARQUE : Après ce premier lavage, l’échantillon peut être laissé toute la nuit à +4 °C si nécessaire.</li>
		<li>Retirer le SN et ajouter 250 μL d’anticorps secondaires dilués dans 1 % de BSA dans PBSX (dilution généralement de 1 500 d’un anticorps étiqueté fluorescent). Couvrir de papier d’aluminium et incuber sur une table rotative (20-30 tr/min) à RT pendant 1 h.</li>
		<li>Répétez 3.2.10.</li>
		<li>Enfin enlever le SN et verser les tubules sur une lame de microscope. Séparer délicatement et disposer les tubules en bandes linéaires à l’aide de pointes de chargement de gel. Égoutter l’excès de tampon et ajouter le milieu de montage et un coverslip. REMARQUE : Évitez de sécher les tubules tout en les arrangeant. La contre-coloration des noyaux avec dapi n’est pas nécessaire dans la plupart des cas. Sceller le bord du coverslip avec du vernis à ongles pour éviter le séchage et la détérioration de l’échantillon. Les diapositives peuvent être stockées pendant 1 à 2 semaines à +4 °C avant l’imagerie.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products.">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li><li>Parvinen, M., S&#246;derstr&#246;m, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis.">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode de microdissection assistée par transillumination que nous avons décrite ci-dessus permet une approche axée sur le stade pour l’étude de la spermatogenèse. La spermatogenèse est un processus hautement synchronisé, et toutes les étapes clés de la différenciation spermatogénique sont régulées et exécutées d’une manière dépendante de l’étape, telles que l’engagement de différenciation (aux stades VII-VIII), l’apparition de la méiose (VII-VIII), les divisions méiotiques (XII), l’apparition de l’allongement du spermatodon (VIII) et la spermiation (VIII)1,26,27. L’analyse scénique fournit un outil puissant pour étudier ces événements particuliers qui sont limités à des étapes spécifiques de la spermatogenèse et ne se trouvent donc qu’à des stades définis du cycle épithélial séminifère. Maîtriser la méthode demande une certaine pratique et l’utilisation d’un microscope de dissection de bonne qualité et des conditions d’éclairage appropriées sont la clé du succès. La mise en œuvre de cette méthode dans le cadre de la boîte à outils quotidienne a la capacité d’améliorer considérablement l’impact et la pertinence biologique de la recherche sur les fonctions reproductives masculines en permettant une dissection plus précise des événements moléculaires pendant la spermatogenèse.
Toutes les souches de souris WT que nous avons étudiées présentent un modèle de transillumination similaire et présentent des associations cellulaires conservées aux stades du cycle épithélial séminifère. À condition que la différenciation spermiogénique des cellules germinales ne soit pas très différente des souris WT, la même chose s’applique également à tous les modèles de souris knock-out que nous avons étudiés. En outre, il peut être appliqué à d’autres espèces qui présentent un arrangement segmental longitudinal des stades du cycle épithélial séminifique7. Toutefois, les espèces dont les stades ne sont pas segmentaux (comme l’homme) ne peuvent pas être utilisées. Étant donné le rôle essentiel de la condensation de la chromatine dans l’allongement des spermatatids dans la définition du modèle de transillumination, il est clair que toute mauvaise réglementation de ce processus empiilait inévitablement la mise en œuvre de cette méthode. Chez les souris juvéniles et les jeunes adultes (5-6 semaines), le modèle de transillumination n’a pas encore été pleinement établi, et, par conséquent, seules les souris de plus de 8 semaines devraient être utilisées. Il est également important de garder à l’esprit que la compression et la traction des tubules empièteront inévitablement sur le modèle de transillumination parce qu’elles déforment l’architecture cellulaire dans l’épithélium séminifère.
Les segments isolés de tubule séminifère peuvent également être cultivés permettant l’observation ex vivo et la manipulation des processus spermatogenesis-couplés, y compris la méiose. Pour assurer la viabilité du tissu et prévenir la dégradation de l’ARN et des protéines, les échantillons doivent être prélevés et traités au plus tard 2 heures après avoir sacrifié la souris. Pour la culture ex vivo des tubules séminifères, le temps du sacrifice à l’apparition de la culture ne doit pas dépasser 1 heure. L’intégrité des fragments de tubules peut généralement être maintenue jusqu’à 72 heures in vitro si elle est récoltée correctement.
Le stade du cycle épithélial séminifère peut être vérifié et encore plus précisément défini à l’aide de la microcopie de contraste de phase des préparations decourge 16. La microscopie est effectuée sur les cellules vivantes, ce qui fournit une dimension supplémentaire dans l’analyse et permet l’observation des mouvements organiques ou cellulaires à des stades spécifiques de la spermatogenèse28,29,30. La microscopie de contraste de phase fournit la mise en scène exacte pour l’immunostaining suivant, qui permet l’analyse très détaillée de l’expression de protéine et de la dynamique de localisation pendant la spermatogenèse, y compris les changements étape-spécifiques.
Tandis que les cellules sont libérées du contexte épithélial dans des préparations de courge, les immunostainings de montage entier des segments de tubule permettent l’étude des cellules spermatogenic dans leur environnement physiologique. Par conséquent, les préparations de montage entier peuvent fournir une meilleure visualisation de l’architecture de tubule séminifère et de ses contacts intercellulaires que l’immunostaining sur des sections transversales. Fait important, la mise en scène assistée par transillumination des segments tubules avant l’immunostaining rend l’approche encore plus puissante en incluant des informations sur l’étape spécifique d’un segment donné. La coloration de montage entier est un outil particulièrement utile pour l’étude des cellules à la périphérie des tubules séminifères, tels que les cellules myoïdes peritubulaires, les macrophages périphériques et la spermatogonie, mais pourrait également ouvrir de nouvelles perspectives dans la recherche sur les cellules germinales méiotiques et postméiotiques.

La différenciation des cellules germinales mâles de la spermatogonie diploïde au spermatozoa haploïde mature, c’est-à-dire la spermatogenèse, est un processus complexe qui a lieu dans l’épithélium des tubules séminifères dans les testicules d’un individu sexuellement mature1. Les descendants mitotiques de la spermatogonie A1 se divisent d’abord cinq fois pour augmenter la population engagée par différenciation, puis entrent dans la méiose sous forme de spermatoocytes qui donnent finalement naissance à des spermatides haploïdes. La différenciation des spermatozods ronds en spermatozoa, c’est-à-dire la spermiogenèse, implique des changements complexes dans la morphologie cellulaire, y compris le compactage nucléaire et la construction de structures spécifiques au sperme telles que l’acrosome et le flagellum. Chez la souris, l’ensemble du processus de spermatogenèse prend 35 jours pour terminer2,3.
À n’importe quel endroit donné, l’épithélium séminifère accueille jusqu’à cinq cohortes de cellules germinales différenciantes plus les cellules souches/progénitrices germinales et les cellules somatiques sertoli1. Les cellules germinales différenciantes forment des couches concentriques dont la composition est prévisible, et les cellules haploïdes à un pas donné de développement s’associent toujours à certains types de spermatocytes et de spermatogonia4,5. Par conséquent, n’importe quelle section transversale d’un tubule accueille des cohortes de cellules germinales d’une composition constante. Ces associations cellulaires spécifiques sont définies comme les stades de l’épithélium séminifère. Les stades en soi ne présentent pas d’états stagnants de type check-point, mais se développent continuellement à mesure que la différenciation des cohortes de cellules germinales progresse ensynchronie 1,2,6. Chez la souris, il y a 12 étapes (I-XII)2 qui sont disposées de façon segmentale le long de l’axe longitudinal du tubule séminifère, et elles se suivent dans un ordre logique formant ainsi l’onde de l’épithélium séminifère, ou vague spermatogénique7,8,9 ( Figure1). L’achèvement de la spermatogenèse prend quatre cycles, et les couches hiérarchiques ou les cohortes de cellules germinales différenciantes dans n’importe quelle section transversale de tubule séminifère sont temporellement un cycle séminifère indépendamment les uns des autres. La durée du cycle dépend des espèces et chez la souris chaque cycle prend 8,6 jours10.
Les stades peuvent être identifiés sur la base de la composition cellulaire et de l’organisation de l’épithélium séminifère sur les sections5 des testicules histologiques (figure 1 et figure 2). Cependant, l’analyse histologique est laborieuse, chronophage et nécessite une fixation et une coloration, et ne peut donc pas être appliquée aux tissus vivants. Fait important, la mise en scène peut également être effectuée sur des tissus vivants sous un microscope à dissection en profitant de modèles distincts d’absorption/dispersion de la lumière exposés à différentes étapes du cycle (figure 2). La capacité de chaque étape d’absorber et de disperser la lumière est relative au niveau de condensation de chromatine des spermatatids post-méiotiques tardifs que n’importe quel hôte de stade donné et l’emballage de ces cellules dans les faisceaux7,11. La différenciation spermatid, c’est-à-direla spermiogenèse, est encore divisée en 16 étapes de développement, y compris 8 étapes de spermatid ronde (étape 1-8) et 8 étapes de différenciation du spermatid allongé (étapes 9-16) (figure 1). Les spermatids allongés de l’étape 9-11 (stade IX-XI) n’affichent qu’un faible niveau de condensation de chromatine, ce qui entraîne l’absorption d’une faible quantité de lumière. La condensation de chromatine commence à l’étape 11 spermatids (stade XI), et l’étape 15-16 allongeant les spermatatids (stade IV-VIII) contiennent la chromatine entièrement condensée, et présentent donc une absorption maximale de lumière (figure 3). La chromatine doit être condensée afin d’être bien emballée dans la tête du sperme. D’autres facteurs qui contribuent au modèle d’absorption de la lumière sont l’emplacement des spermatatids allongés dans l’épithélium (basal vs apical) et le regroupement des spermatatids allongés (prononcés aux stades II-V)11 (Figure 3). Les faisceaux sont considérés comme des taches au milieu des tubules et comme des rayures sur les bords sous un microscope de dissection et plus la chromatine est condensée, plus la tache/bande11 est foncée.
Cet article décrit l’utilisation de la méthode de microdissection transillumination-aidée pour l’isolement des segments seminifères de tubule représentant des étapes spécifiques du cycle épithélial séminifère. Une fois isolés, les segments de tubules mis en scène peuvent faire l’objet de diverses analyses en aval, y compris les analyses biochimiquesde l’ARN et des protéines 12,13,14,15, cytométrie du débit16, culture ex vivo tubule17 et immunostaining18. Ici, nous fournissons également des protocoles détaillés en aval pour préparer les monocouches écrasées des segments de tubules par étapes pour l’analyse morphologique des cellules vivantes et l’immunostaining subséquent, ainsi que des immunostainings de montage entier des segments de tubule. Le flux de travail en un mot décrit dans la figure 4.
La méthode de microdissection assistée par transillumination permet l’identification et l’isolement précis des cellules germinales à des étapes spécifiques de différenciation grâce à la composition cellulaire synchronisée des stades. Fait important, il permet également l’étude d’événements dépendant des stades pendant la spermatogenèse sur les tissus vivants. Étant donné l’absence de modèles in vitro évolutifs pour la spermatogenèse, cette méthode a également un avantage unique de permettre des études développementales et toxicologiques ciblées à court terme sur des segments tubules spécifiques à l’étape ex vivo12,17. Alors que nous décrivons la méthode ici pour la souris, la même procédure peut être appliquée à toutes les espèces de mammifères avec arrangement longitudinal et segmental des stades épithéliales séminifères, tels que le rat4,7,15,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

Spermatogenesis est un processus de différenciation unique qui donne finalement lieu à l’un des types de cellules les plus distincts du corps, le sperme. La différenciation des cellules germinales a lieu dans les poches cytoplasmiques des cellules somatiques sertoli qui hébergent simultanément 4 à 5 générations de cellules germinales et coordonnent et synchronisent leur développement. Par conséquent, la composition des types de cellules germinales dans une section transversale est constante, et ces associations cellulaires sont également connues sous le nom de stades (I-XII) du cycle épithélial séminifère. Fait important, les stades peuvent également être identifiés à partir de tubules séminifères intacts en fonction de leurs caractéristiques différentielles d’absorption/dispersion de la lumière révélées par la transillumination, et du fait que les stades se suivent le long du tubule dans un ordre numérique. Cet article décrit une méthode de microdissection transillumination-aidée pour l’isolement des segments seminifères de tubule représentant des étapes spécifiques du cycle épithélial séminifique de souris. Le modèle d’absorption de la lumière des tubules séminifères est d’abord inspecté au microscope à dissection, puis les segments de tubules représentant des étapes spécifiques sont coupés et utilisés pour des applications en aval. Ici, nous décrivons les protocoles d’immunostaining pour les préparations de courges spécifiques à l’étape et pour les segments intacts de tubule. Cette méthode permet à un chercheur de se concentrer sur les événements biologiques qui se déroulent à des phases spécifiques de spermatogenèse, fournissant ainsi un outil unique pour les études développementales, toxicologiques et cytologiques de la spermatogenèse et des mécanismes moléculaires sous-jacents.

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Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Ce protocole décrit la microdissection transillumination-aidée des segments des tubules séminifères adultes de souris représentant des étapes spécifiques du cycle épithélial séminifère, et des types de cellules là, et l’immunostaining suivant des préparations de courge et des segments intacts de tubule.

Dissection assistée par transillumination d’étapes spécifiques du cycle épithélial séminifique de la souris pour les analyses d’immunostaining en aval

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

transillumination-assisted-dissection-specific-stages-mouse

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6.8K vues.  University of Turku, Turku, Finland. Ce protocole décrit la microdissection transillumination-aidée des segments des tubules séminifères adultes de souris représentant des étapes spécifiques du cycle épithélial séminifère, et des types de cellules là, et l’immunostaining suivant des préparations de courge et des segments intacts de tubule.

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

-Étape spécifique de tri Spermatides souris par cytométrie en flux

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Recherche

Biologie du développement

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolement de souris endométriale épithéliales et stromales Cellules pour<em&gt; In vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Enregistrements de puces et de cellules entières de cellules épithéliales primaires isolées de l&#39;épididyme

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissection et culture du rein embryonnaire de la souris

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

Dissection et préparation de tranches coronales de développer la glande pituitaire souris

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Une Technique de Squash de tube séminifère pour l’analyse cytologique de la spermatogenèse en utilisant le modèle de souris

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Préparation des tissus et immunostaining des tissus craniofacial de souris et de l'os non décalcifié

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Dissection, culture et analyse des cellules neurales primaires de crête neurale de la souris pour l'étude de la délamination et de la migration neurales de cellules de crête

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...