De nombreux antigènes vaccinaux sous-unitaires candidats sont des protéines membranaires. Historiquement, ceux-ci ont été difficiles à produire et à purifier en quantités suffisantes. Avec cette technique, nous sommes en mesure de créer des antigènes d’intérêt intégrés dans une membrane lipidique pour aider à assurer une confirmation de type natif.
Ce processus facilite également la formulation avec des adjuvants d’intérêt. L’expression acellulaire permet la production rapide de protéines d’intérêt dans leur structure native sans étiquette. Cette technique est également évolutive et nous travaillons déjà avec des sociétés commerciales pour développer des formulations vaccinales utilisant ce processus.
Nous démontrons ici le processus pour un antigène de chlamydia, mais le processus pourrait être facilement adapté pour produire des antigènes d’intérêt, qu’il s’agisse ou non de protéines membranaires. Ce processus peut s’appliquer à la fois à la mise au point d’agents pathogènes et de vaccins contre le cancer. Pour commencer, préparez les MOMP-tNLP en utilisant une méthode sans cellule.
Décongelez le tampon de reconstitution du kit d’expression protéique acellulaire deux heures avant de régler la réaction et ajoutez un inhibiteur de protéase sans EDTA au tampon. Utilisez un kit conçu pour exécuter cinq réactions d’un millilitre. Pour chaque réaction d’un millilitre, ajoutez 525 microlitres de tampon de reconstitution dans le flacon de lysat d’E. coli et roulez-le pour le dissoudre.
Ajouter 250 microlitres du tampon de reconstitution dans le flacon de réaction contenant l’additif et dissoudre par roulage. Ensuite, ajoutez 8,1 millilitres de tampon de reconstitution au flacon d’alimentation à réaction et roulez-le pour le dissoudre. Dans une bouteille de mélange d’acides aminés, ajoutez trois millilitres de tampon de reconstitution pour le dissoudre.
À une autre bouteille de méthionine, ajoutez 1,8 millilitre de tampon de reconstitution, dissolvez-la et stockez-la sur de la glace. Ajouter 225 microlitres du mélange reconstitué, 270 microlitres du mélange d’acides aminés reconstitués sans méthionine et 30 microlitres de méthionine reconstituée dans le flacon de lysat E. coli. En outre, ajoutez 400 microlitres du mélange DMPC / télodendrimère, 15 microgrammes de plasmide MOMP et 0,6 microgramme de delta-49ApoA1 au mélange et mélangez-le.
Aliquote 20 microlitres de la solution totale dans un tube de 1,5 millilitre Pour une réaction de contrôle exprimant la GFP. Préparer une solution alimentaire en ajoutant 2,65 millilitres du mélange d’acides aminés reconstitué sans méthionine et 300 microlitres de méthionine reconstituée. Transférez un millilitre de la solution réactionnelle dans la chambre de réaction interne du kit de réaction sans cellule et scellez-le.
Remplissez la chambre extérieure de la cuve de réaction avec 10 millilitres de solution d’alimentation et fermez-la. Ajouter 0,5 microlitre du plasmide témoin GFP aux aliquotes de 20 microlitres du mélange réactionnel. Mettez la réaction dans un agitateur à 300 rotations par minute pendant 18 heures à 30 degrés Celsius.
Surveillez la réaction sous une lumière UV après 15 minutes pour la fluorescence due à la synthèse de GFP. Purifier le complexe de nanoparticules MOMP-tNLP du mélange réactionnel acellulaire par chromatographie d’affinité au nickel immobilisée à l’aide du marqueur HIS sur la protéine delta-49ApoA1. Transférer un millilitre de la boue à 50% de la résine de purification HIS-tag dans une colonne de chromatographie jetable de 10 millilitres et ajouter trois millilitres de tampon de liaison pour équilibrer.
Ensuite, vidangez le tampon et ajoutez 250 microlitres de tampon de liaison à la résine. Extraire 20 microlitres du mélange réactionnel acellulaire pour l’analyse SDS-PAGE. Ajouter le reste du mélange réactionnel acellulaire avec la résine équilibrée et incuber sur une bascule de laboratoire pendant une heure à quatre degrés Celsius.
Retirez le capuchon de colonne et lavez-le avec 500 microlitres de tampon de liaison. Ajouter le liquide de lavage à la colonne et recueillir le flux pour l’analyse SDS-PAGE. Laver la colonne avec un millilitre de tampon de lavage avec de l’imidazole 20 millimolaires six fois et recueillir les fractions.
Pendant le lavage pour la deuxième fois, utilisez une pipette d’un millilitre pour agiter la résine. Éluer les MOMP-tNLP dans six fractions de 300 microlitres du tampon d’élution I contenant 250 millimolaires d’imidazole et une élution finale avec 300 microlitres de tampon d’élution II contenant 500 millimolaires d’imidazole. Lors de la deuxième élution, agiter vigoureusement la résine en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette d’un millilitre.
Utilisez un imageur gel pour capturer les images à 600 nanomètres. Ensuite, quantifier la quantité de protéines différentes dans les nanoparticules grâce à l’analyse SDS-PAGE à l’aide d’un étalon protéique. Tracez une courbe standard en utilisant les densités des bandes MOMP.
Ensuite, déterminez le composant MOMP des nanoparticules avec l’étalon. Résoudre les échantillons par SDS-PAGE et transférer les piles de gel à l’aide d’un système commercial de transfert à sec pour l’analyse par transfert Western. Retirez les taches de la pile et incuberez-les pendant une nuit à quatre degrés Celsius dans un tampon de blocage contenant 0,2% TWEEN 20 et 0,5 microgrammes par millilitre MAb40, ou 0,2 microgramme par millilitre d’anticorps antiHIS-tag MAbHIS dirigé contre le HIS-tag de la protéine delta-49ApoA1.
Lavez chaque tache avec du PBST trois fois pendant cinq minutes par lavage. Incuber les transferts pendant une heure dans un tampon de blocage contenant un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore dans une dilution de 1:10 000. Répétez les lavages avec PBST et capturez l’image à l’aide d’un imageur à fluorescence après le lavage final.
À l’aide d’un appareil de transfert de points, éponger trois microgrammes de MOMP-tNLP et de tNLP vide. Développer et bloquer les transferts en utilisant la même méthode pour le Western blot. Congeler la solution mélangée sur de la glace sèche et la lyophiliser pendant la nuit à l’aide d’un lyophilisateur.
Conservez les formulations séchées à moins 20 degrés Celsius. Au besoin, reconstituez les tNLP lyophilisés avec de l’eau exempte d’endotoxines et roulez-les pour les dissoudre et les réhydrater. Dialyser la solution avec du PBS et retirer le tréhalose avec une membrane de dialyse coupée de 3,5 kilodaltons.
Centrifuger la solution de nanoparticules dans un concentrateur sous vide avant d’ajouter l’adjuvant. Surveillez le volume de l’échantillon après 20 à 30 minutes pour éviter un séchage complet. Dans une enceinte de biosécurité, ajouter l’adjuvant dans des conditions stériles.
À l’aide de la chromatographie analytique d’exclusion de taille, analyser la formulation pour une incorporation réussie. Conservez les MOMP-tNLP avec adjuvant et videz la TNLP à quatre degrés Celsius pendant 14 jours maximum. Analyser la stabilité de la formulation tNLP avec chromatographie d’exclusion de taille.
L’analyse SDS-PAGE de MOMP-tNLP a été réalisée par chromatographie d’affinité au nickel, qui a démontré que le mélange réactionnel acellulaire a des niveaux élevés d’expression pour les protéines MOMP et delta-49ApoA1. En utilisant la densitométrie sur gel, la concentration de MOMP a été quantifiée à l’aide d’un MOMP recombinant purifié avec une concentration connue comme étalon. Pour déterminer la formation d’oligomères, SDS-PAGE MOMP et MOMP-tNLP ont été traités avec de la chaleur et du DTT, qui ont montré des bandes distinctes pour MOMP et delta-49ApoA1.
L’analyse par transfert Western utilisant un anticorps MAb40 a été utilisée contre la protéine MOMP, qui a révélé un schéma de bandes confirmant la formation d’oligomères par la protéine MOMP dans son état non dénaturé. Un test par transfert de points a été effectué en présence d’anticorps MAb40 et MAbHIS, ce qui a indiqué la formation de MOMP-tNLP. Cependant, la TNLP vide a montré un signal positif pour MAbHIS.
Les sérums des souris immunisées injectées avec adjuvant MOMP-tNLP ont démontré une forte liaison MOMP et ont indiqué que MOMP-tNLP pouvait provoquer une réponse immunitaire. Étant donné que ce protocole génère des protéines à partir de l’ADN, il est essentiel d’éviter de contaminer la réaction avec la DNase, la RNase, ainsi que l’ADN et l’ARN étrangers. Tous les matériaux ou réactifs utilisés dans les réactions doivent être exempts de ce type de molécules.
Après expression, purification et ajout d’adjuvants, ces candidats vaccins peuvent être évalués dans des modèles animaux appropriés pour les agents pathogènes d’intérêt afin d’évaluer les marqueurs d’activation immunitaire ou d’évaluer la protection lors d’une provocation. Pour la chlamydia, la principale protéine de la membrane externe, ou MOMP, est considérée comme l’un des principaux antigènes candidats pour les vaccins sous-unitaires depuis de nombreuses années, mais elle a été difficile à produire aux échelles nécessaires à l’application du vaccin. La co-expression acellulaire de cette protéine membranaire est un moyen viable de commencer à faire passer cette protéine à l’évaluation dans des modèles animaux tels que les souris, et éventuellement à des tests humains.
