L’un des principaux défis dans l’ingénierie d’un tissu cardiaque humain comprend sa vascularisation. Notre laboratoire a développé un modèle in vitro du cœur humain en co-culture des cellules trouvées in vivo. Il s’agit notamment des myocytes cardiaques, des fibroblastes cardiaques et des cellules endothéliales cardiaques.
Toutes ensemble, ces cellules permettent la récapitulation du microenvironnement cardiaque humain, y compris ses composants moléculaires, cellulaires et extracellulaires. Nous les utilisons dans notre laboratoire pour tester différents médicaments pour des essais de toxicité des médicaments. Il s’agit notamment de la doxorubicine, un médicament cardiotoxique bien connu qui affecte les cœurs humains, même les années suivant son traitement.
Nous faisons la culture des fibroblastes cardiaques, des cellules endothéliales et des myocytes séparément avant de former des sphéroïdes. Afin de cultiver des cardiomyocytes, nous recueillons le flacon de moins 80 degrés et nous le réchauffons à 37 degrés pendant quatre minutes dans un bain d’eau. Nous pulvérisons ensuite le flacon cryo avec 70% d’éthanol et le déplacer vers une armoire de biosécurité.
Nous recueillons délicatement la suspension cellulaire et la transférons dans un tube Falcon de 15 millilitres. Nous recueillons un millilitre de milieu de placage d’avant-guerre, rinçons le flacon cryo une fois, puis l’ajoutons au tube Falcon de 50 millilitres, une goutte à la fois toutes les quatre secondes. Tout en y ajouter le milieu de placage, agiter délicatement le tube Falcon.
À l’intérieur d’une pipette cellulaire, recueillir sept millilitres de placage moyen et l’ajouter délicatement au tube Falcon de 15 millilitres. Une fois ajouté le volume final du milieu de placage au tube Falcon, transférez la suspension cellulaire aux flacons de tissu codés par fibronectine. Enfin, déplacez les cellules vers un incubateur.
Après deux jours, nous recueillons les flacons de tissu de l’incubateur et nous vérifions la confluence cellulaire au microscope. À ce stade, nous déplaçons le flacon vers une armoire de biosécurité et nous enlevons le support de placage. Nous rinçons doucement les cellules avec le même milieu de placage du flacon de tissu quatre ou cinq fois.
Nous le remplaçons par un milieu d’entretien frais et les déplaçons dans un incubateur pour un à deux jours supplémentaires. Le jour où nous créons des tentures de cultures, nous recueillons les trois types de cellules de l’incubateur. Nous chip dans les cellules en enlevant les médias.
Nous les rinçons avec trois millilitres de PBS. Et enfin, nous ajoutons les puces dans les cellules. Les flacons sont ensuite déplacés dans un incubateur et incubés jusqu’à cinq minutes.
Afin de générer des sphéroïdes cardiaques, nous co-culture 20.000 cellules par goutte suspendue. Ça comprend 10 000 cardiomyocytes, mille fibroblastes cardiaques et 5000 cellules cardiaques intérieures. Ceux-ci sont co-cultivés dans la chute suspendue 384 plaques de puits.
Ils sont plaqués à l’aide de notre système de manipulation liquide. Nous ajoutons également pbs sur les parois latérales des plaques de chute suspendues pour empêcher les cultures de sécher dans l’incubateur. Déplacez soigneusement la plaque de chute suspendue contenant des cellules à l’incubateur.
Entre trois et quatre jours, des sphéroïdes se formeront. Nous recueillons la plaque de chute suspendue de l’incubateur et nous vérifions que des sphéroïdes se forment à l’intérieur de chaque puits. Comme le montrent ces images, nous avons un ensemble de sphéroïdes au centre de chaque puits.
Une fois formés, nous recueillons des sphéroïdes et les intégrions dans des gels de collagène. Une pointe de pipette est coupée à l’intérieur afin d’éviter les dommages sphéroïdes. Les sphéroïdes sont collectés et transférés dans un tube Falcon de 50 millilitres où ils sont rassemblés.
Nous rachbinons la suspension sphéroïde à 300 G pendant cinq minutes pour les séparer du milieu. Nous utilisons des plaques de puits à paroi foncée 96 pour l’image sphéroïdes, le média est enlevé ou remplacé par un gel de collagène dans un tube Falcon. L’hydroxyde de sodium est ajouté à la suspension en gel sphéroïde avant qu’il ne soit plaqué dans la plaque murale foncée.
100 microlitres de suspension sphéroïde sont ajoutés dans chaque puits et incubés pendant 30 minutes à 37 degrés. Les médicaments, y compris la doxorubicine et d’autres agents sont ajoutés à la plaque sphéroïde et incubés pendant 24 heures. Le lendemain, nous avons préparé une solution contenant du calcium AM et de l’éthidium homodimer, l’étiquetage vivant sous les cellules respectivement.
Cette solution est préparée en ajoutant la pièce de dix cents à cette plaque de filtre. Les sphéroïdes sont ensuite incubés à 37 degrés pendant une heure. Nous utilisons un lecteur de plaque pour mesurer la fluorescence du calcium AM et de leur homodimer d’éthidium dans la plaque.
Ces mesures sont ensuite utilisées par notre logiciel pour effectuer une analyse statistique. Nous mesurons l’activité contractile des sphéroïdes traités avec les différents médicaments à l’aide d’un système optique ion. Les sphéroïdes sont déplacés à la scène entre deux électrodes.
Ceux-ci permettent à la fois de contrôler et de mesurer l’activité contractile par potentiel sur le terrain. De cette façon, nous pouvons tester différentes tensions et gammes de fréquences pour stimuler les sphéroïdes. Un sphéroïde à l’époque est photographié, et utilisé pour ces mesures.
Les sphéroïdes qui n’ont pas reçu de doxorubicine pourront construire à la suite de la stimulation électrique. Au contraire, les sphéroïdes traités à la doxorubicine ne se contractent pas. Pour visualiser la forme du réseau cellulaire endothélial dans chaque sphéroïde, nous les avons fixés avec une solution de paraformaldéhyde de 4% pendant une heure à température ambiante.
Nous avons déplacé la plaque vers un shaker qui permet la perméation douce de la solution à travers le gel. Le PFA est enlevé et rincé trois fois avec une solution PBS contenant 0,01% d’oxyde de sodium. Nous avons apporté la mobilisation bien sûr en ajoutant une solution de 0,02% de Triton X en PVSA pendant 20 minutes à température ambiante.
La solution de blocage contient 3%BSA dans PBC, qui est ensuite ajouté à la plaque pendant une heure à température ambiante. Une solution contenant l’anticorps primaire contre le CD 31. Un marqueur pour l’endothélial est ajouté à la plaque qui est ensuite incubée pendant la nuit à quatre degrés.
Le lendemain, la solution d’anticorps primaire est enlevée et la plaque rincée trois fois avec une solution PBS contenant 0,01% d’oxyde de sodium. La solution d’anticorps secondaire contenant la tache d’hex ainsi est ajouté à la plaque qui est ensuite incubée pendant la nuit à quatre degrés. Enfin, la deuxième solution d’anticorps est enlevée et la plaque rincée trois fois avec une solution PBS contenant 0,01% d’oxyde de sodium.
Après être resté avec des anticorps primaires et secondaires, la plaque peut être photographiée à l’aide de notre microscope confocal. Un réseau vasculaire approprié est essentiel pour la survie et la fonction des cellules cardiaques. Les sphéroïdes cardiaques présentent un réseau cellulaire endothélial qui récapitule mieux celui présent dans le cœur humain par rapport aux cultures monocouceuses des cellules cardiaques.
Compte tenu des caractéristiques uniques, les sphéroïdes cardiaques représentent des outils avancés pour les tests in vitro pour la recherche cardiovasculaire.
