Cette méthode peut être utilisée pour identifier et caractériser les éléments régulateurs qui contrôlent la traduction pendant la maturation des ovocytes. Nous avons appliqué la microscopie de time-lapse pour évaluer l’accumulation de rapporteur dans toute la maturation in vitro d’oocyte. Cela permet de déterminer avec précision le moment où l’activation translationnelle ou la répression a lieu pendant la maturation des ovocytes.
Pour commencer, ouvrez soigneusement les follicules antraux en faisant une petite coupe dans la paroi du follicule avec une aiguille de calibre 26. Isolez les COC intacts avec plusieurs couches de cellules de cumulus à l’aide d’une pipette en verre actionnée par la bouche. Utilisez une pipette plus petite et denudez mécaniquement les COC par pipetage répété.
Aspirer les ovocytes dénudés et les placer dans une boîte de Pétri avec un milieu de maturation complété par une micromolaire de cilostamide. Placez le plat dans un incubateur pendant deux heures pour laisser les ovocytes récupérer du stress induit par leur isolement des follicules. Placez un tube capillaire en verre borosilicate de 10 centimètres de long dans un tiroir mécanique pour préparer les aiguilles d’injection.
Pliez la pointe de l’aiguille à un angle de 45 degrés à l’aide d’un filament chauffé pour une injection optimale. Placez 20 gouttelettes microlitres du milieu de collecte des ovocytes de base dans un plat en polystyrène et couvrez les gouttelettes d’huile minérale légère. Préparez un plus grand volume de mélange de rapporteurs en ajoutant 12,5 microgrammes par microlitre d’UTR Ypet et de mCherry chacun.
Conservez les aliquotes de ceux-ci à moins 80 degrés Celsius. Lors de la décongélation, centrifuger la partie aliquote pendant deux minutes à 20 000 fois G, puis la transférer dans un nouveau tube à microcentrifugation. Chargez l’aiguille d’injection avec environ 0,5 microlitres de mélange de rapporteur.
Placez la pipette de maintien et l’aiguille d’injection dans les supports et placez-les dans la gouttelette du milieu de collecte des ovocytes. Ouvrez l’aiguille d’injection en la tapotant doucement contre la pipette de maintien. Placer les ovocytes dans une gouttelette de milieu de collecte de base et injecter cinq à 10 picolitres du mélange rapporteur.
Incuber les ovocytes et le milieu de maturation avec un cilostamide micromolaire pendant 16 heures pour permettre au signal mCherry de se stabiliser. Pour la microscopie time-lapse, préparer une boîte de Petri avec deux gouttelettes de 20 microlitres de milieu de maturation pour chaque rapporteur injecté, une gouttelette avec un cilostamide micromolaire pour contrôler les ovocytes arrêtés par I de la prophase, et une gouttelette sans cilostamide pour les ovocytes en maturation. Couvrez les gouttelettes d’huile minérale légère et placez-les dans l’incubateur.
Après pré-incubation, retirez les ovocytes injectés de l’incubateur et lavez-les quatre fois dans un milieu de maturation sans cilostamide. Gardez certains ovocytes dans un milieu de maturation avec un cilostamide micromolaire comme groupe témoin d’ovocyte de la prophase I. Transférer les ovocytes injectés dans leurs gouttelettes respectives sur la parabole du microscope time-lapse préalablement préparée.
Regroupez les ovocytes avec une pipette en verre fermée pour empêcher leur mouvement pendant l’enregistrement. Placez la parabole au microscope équipée d’un système d’élimination des diodes électroluminescentes et d’une scène motorisée équipée d’une chambre environnementale maintenue à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en utilisant les paramètres mentionnés dans le manuscrit de texte. Entrez les paramètres appropriés pour l’expérience time-lapse en cliquant sur Applications, puis sur Acquisition multidimensionnelle.
Sélectionnez le premier onglet Main, puis sélectionnez time-lapse, plusieurs positions de scène et plusieurs longueurs d’onde. Sélectionnez l’onglet Enregistrement pour entrer l’emplacement où l’expérience doit être enregistrée. Sélectionnez ensuite l’onglet Time-Lapse pour entrer le nombre de points de temps, la durée et l’intervalle de temps.
Sélectionnez l’onglet Scène, activez brightfield et localisez la position des ovocytes en ouvrant une nouvelle fenêtre et en sélectionnant Acquérir, Acquérir et Afficher en direct. Une fois les ovocytes localisés, revenez à la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle et appuyez sur plus pour définir l’emplacement des ovocytes. Sélectionnez l’onglet Longueurs d’onde et définissez trois longueurs d’onde différentes pour brightfield, YFP et mCherry.
Ajustez l’exposition pour Ypet et mCherry, puis démarrez l’expérience time-lapse en cliquant sur Acquérir. Pour l’analyse de la translation UTR à trois nombres premiers de Ypet, effectuez deux mesures de région pour chaque ovocyte, l’ovocyte lui-même en cliquant sur la région de l’ellipse et une petite région entourant l’ovocyte à utiliser pour la soustraction d’arrière-plan en cliquant sur la région rectangulaire. Exportez les données de mesure de région vers une feuille de calcul en cliquant sur Ouvrir le journal, puis sur Consigner les données.
Pour chaque ovocyte individuel et pour tous les points de temps mesurés, soustrayez la mesure de la région d’arrière-plan de la mesure de la région ovocytaire séparément pour les longueurs d’onde YFP et mCherry. L’expression de mCherry et de YFP dans la prophase I et les oocytes de maturation a été enregistrée dans 39 oocytes, dont 30 ont été mûris, et neuf ont été arrêtés dans la prophase I comme commande négative. Des rapports individuels de YFP à mCherry pour des signaux des ovocytes I-arrêtés et de maturation de prophase ont été corrigés pour le volume injecté en divisant le signal de YFP par le signal moyen de mCherry des 10 derniers points de temps pour les ovocytes I-arrêtés et mûrissants de prophase.
Des taux de traduction du rapporteur YFP ont été mesurés par la courbe ajustant les rapports YFP à mCherry dans la prophase I et dans les ovocytes de maturation pendant les premières zéro à deux heures, ou huit à 10 heures après libération de cilostamide utilisant la régression linéaire. L’accumulation du rapporteur ne suit pas un modèle linéaire, comme l’indique une différence significative dans les taux de traduction entre zéro à deux heures et huit à 10 heures après la libération de cilostamide, indiquant l’activation de la traduction de l’interleukine 7 au cours de la maturation myotique des ovocytes. Lorsque vous essayez ce protocole, assurez-vous que le temps d’exposition est adéquat au début de l’enregistrement.
Gardez à l’esprit que le signal peut saturer pendant le cours du temps si la traduction est activée pendant la reprise méiotique des ovocytes. La stabilité du MRMA peut être confirmée par PCR, en utilisant des amorces pour YFP. Pour confirmer les changements de traduction, vous pouvez utiliser western blotting avec un anticorps contre un technicien V5.
