Ce flux de travail de dissection et d’analyse complet fournit une nouvelle approche pour analyser la morphologie complète des tonnelles nerveuses gustatives individuelles, la transduction des nombres de types de cellules et les relations physiques entre les cellules. La collecte de l’épithélium lingual entier nous permet de mesurer le nombre absolu de cellules et le volume d’innervation dans l’ensemble de la papille gustative. Cette approche est plus précise que les estimations de la structure cellulaire basées sur l’échantillonnage de sections, ce qui réduit la variabilité technique.
C’est aussi la première méthode fournissant une analyse détaillée des cellules des papilles gustatives par rapport à leur innervation. Cette méthode peut améliorer les investigations sur les circuits potentiels dans la papille gustative, ainsi que sur les processus pathologiques et les chimiothérapies qui perturbent la fonction gustative normale. Dans la plupart de ces cas, il n’est pas clair quelle structure ou relation est perturbée, donc le maintien de tous ces facteurs intacts permet toutes les analyses dans une seule préparation.
L’erreur la plus courante est d’essayer d’éviter d’endommager l’épithélium en ne disséquant pas assez près de la face inférieure de l’épithélium. Il est impératif d’enlever autant de tissu sous-jacent que possible avant de congeler le tissu dans le moule tissulaire. Il est également important de s’assurer que l’épithélium est posé à plat dans le fond du moule tissulaire.
Commencez par décongeler et rincer la langue dans un tampon de phosphate molaire de 0,1. Placez ensuite 1/2 de la langue antérieure contenant les papilles fongiformes sur une lame de verre sous un microscope à dissection. Utilisez des pinces émoussées et des ciseaux à dissection pour retirer le muscle et maintenir le tissu ouvert lorsque l’épithélium lingual est incurvé, assurant une orientation plate du tissu en maintenant les lames des ciseaux de dissection grossière parallèles à l’épithélium.
Jetez l’épithélium ventral non kératinisé de la langue car il ne contient pas de papilles gustatives. Utilisez ensuite des ciseaux à dissection fine pour une dissection plus proche de la face inférieure de l’épithélium kératinisé. Utilisez une pince à extrémité émoussée pour déposer un morceau d’épithélium dans un moule en tissu et assurez-vous qu’il repose à plat.
Ajoutez ensuite une goutte de composé à température de coupe optimale, ou OCT, au tissu. Placez le moule à papier sur une base métallique préalablement refroidie sous la lunette de dissection, puis continuez à tapoter légèrement le tissu avec la pince jusqu’à ce que l’OCT ait gelé, en veillant à ce que le tissu gèle aussi plat que possible. Une fois que l’OCT a gelé, ajoutez rapidement de l’OCT supplémentaire et placez le moule dans un bécher de 2-méthylbutane refroidi jusqu’à ce qu’il soit congelé.
Montez le moule OCT sur le cryostat et coupez-le en sections de 20 microns. Recueillez chaque section et visualisez-la au microscope optique pour évaluer sa proximité avec la base de l’épithélium. Une fois le tissu rasé de la face inférieure de l’épithélium, décongelez l’épithélium et rincez-le deux fois dans 0,1 molaire PB sur un shaker.
Coupez le palais dur avant la jonction du palais mou et du palais dur, puis séparez le palais mou du tissu sous-jacent, en vous assurant que tous les fragments d’os restants sont coupés et en enlevant le muscle et le tissu conjonctif supplémentaires. Tenez le palais avec une pince à extrémité émoussée et retirez les glandes restantes et perdez le tissu conjonctif en les grattant doucement avec une lame de rasoir. Les papilles gustatives entières et toute l’innervation des papilles gustatives chez les souris Phox2b-Cre TdTomato ont été marquées en colorant l’épithélium lingual avec des anticorps contre DsRed et la kératine huit.
Le volume des papilles gustatives a été mesuré et n’a révélé aucune corrélation entre les volumes des papilles gustatives et les volumes d’innervation dans les régions de mesure fongiforme ou circonvallate. L’administration d’une faible dose de tamoxifène chez les souris TrkB CreER TdTomato provoque une recombinaison génique et le marquage d’un petit nombre de neurones. Une papille gustative de montage entier colorée avec des marqueurs cellulaires transducteurs de goût anhydrase carbonique quatre et phospholipase C bêta deux est montrée ici.
Cette papille gustative a deux tonnelles terminales étiquetées, qui sont montrées avec la papille gustative retirée après la reconstruction des fibres. L’utilisation d’un logiciel d’imagerie basé sur des pixels cellulaires pour déterminer la proximité la plus proche entre les fibres nerveuses et les cellules transductrices de goût a révélé que sur 19 cellules transductrices de goût, la tonnelle terminale bleue se trouvait à moins de 200 nanomètres de la cellule quatre plus de l’anhydrase carbonique bleu clair. La tonnelle terminale associée au tracé vert est représentée en magenta et se trouve à moins de 200 nanomètres des quatre cellules de l’anhydrase carbonique bleu clair et bleu foncé quatre cellules et plus.
La coloration à la kératine huit et à la 5-éthyynyl-2'désoxyuridine ou EdU des papilles gustatives fongiformes a révélé que des cellules marquées par l’EdU étaient présentes à l’intérieur et à l’extérieur des papilles gustatives. Les noyaux magenta et violet sont observés à l’extérieur de la bordure de kératine huit plus de la papille gustative. Les cellules jaunes, sarcelles et bleues étaient dans la papille gustative.
Lors de la tentative de ce protocole, les étapes de dissection tissulaire et de congélation sont cruciales. Ces méthodes de dissection tissulaire peuvent être suivies d’une coloration pour une variété de cellules et de structures afin d’analyser les relations à la fois dans la papille gustative et à l’extérieur de la papille gustative, mais dans la papille. Il s’agit de la première analyse des tonnelles gustatives entières dans la papille gustative, ainsi que de leurs relations avec les cellules transductrices du goût.
La conservation et la coloration de plusieurs de ces éléments en une seule préparation élargissent les possibilités d’analyse et affinent les mesures possibles.
