Nous tenons à remercier Aimee Myers et Quayson Esi pour les compétences techniques et d&#39;aide. Ce travail a été soutenu en partie par la NSF 0216310 et Givaudan Inc subvention de scolarisation (TNS).

1. Obtention humaines papilles gustatives fongiformes <ol><li> Retirer de quatre à huit papilles humaine goût fongiformes de la surface dorsale de la partie antérieure de la languette à l&#39;aide microciseaux ressort courbées. </li><li> Mettre immédiatement en place dans une solution d&#39;isolation (26 mM de 3 NaHCO, 2,5 mM NaH 2 PO 4, 20 mM de glucose, 65 mM de NaCl, 20 mM de KCl, et 1 mM d&#39;EDTA dissous dans une eau sans nucléase et stérilisé par filtration). </li></ol> 2. Human Digestion fongiformes papilles gustatives Human papilles fongiformes cellules gustatives peut être dissociée en utilisant deux différents protocoles de digestion enzymatique avec de légères différences. <ol><li> Incuber fongiformes papilles dans une solution d&#39;isolation avec de la pronase (1 mg / ml, Sigma Aldrich) et de l&#39;élastase (1 mg / ml Sigma Aldrich) à température ambiante pendant 30-45 min (protocole 1). </li><li> Incuber fongiformes papilles avec de la collagénase de type I (550 U / ml, à partir de Worthington) + élastase (10 U / ml, à partir de moûtHington) + inhibiteur de la trypsine (0,9 mg / ml, à partir de Worthington) dans 2 ml de solution de Ringer de calcium libre dans 35 ° C bain d&#39;eau à la circulation pendant 30 minutes et l&#39;oxygénation douce avec 95% d&#39;O 2/5% de CO 2. (Alternative pour la digestion, le protocole 2) </li><li> Après incubation, laver les papilles avec de la sonnerie et triturer les papilles avec le feu poli pipette en verre Pasteur pour 10 fois. </li><li> Il Centrifuger pendant 3 minutes à 2500 rpm à température ambiante et retirez solution d&#39;isolation et ajouter 1 ml de milieu de culture cellulaire goût. </li><li> Transfert digéré fongiformes papilles dans un plat en verre. </li><li> Disséquer fongiformes papilles en douceur avec le rasoir chirurgicale. </li><li> Ajouter 250 pi de papilles disséqué dans le cylindre de clonage sur la lamelle du collagène de queue de rat de type-1 enduit. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu de culture cellulaire goût dans chaque puits. </li></ol> 3. Culture de cellules humaines fongiformes papilles gustatives <ol><li> Incuber la plaque à 36 ° C dans un humidifiéincubateur contenant 5% de CO 2. </li><li> Placez-les dans un endroit non aménagé incubateur pendant 2 jours avant le premier changement de milieu complet. Cellules gustatives finira par se lier à la lamelle enduit, bien qu&#39;il ne soit pas clairement visible dans 1 à 3 jours. </li><li> Retirer le cylindre de clonage de la plaque et moyennes complètement et ajouter 1 ml de milieu cellules gustatives dans chaque puits. </li><li> Remplacer 1/3 de tous les moyens de 6-7 jours. Ne changez pas le plus souvent à moyen et / ou complètement. </li><li> Vérifiez la croissance des cellules au microscope tous les autres jours. La plupart des nouvelles cellules se développent au-dessous des amas de cellules. Amas de cellules généralement détacher au bout de 2-3 semaines de culture en laissant les cellules nouvellement générées. </li><li> Une fois 40-50% du cylindre de clonage est recouverte en expansion cellules du goût, trypsiniser cellules en utilisant 0,25% p / v de trypsine / EDTA pendant 2-3 minutes à 36 ° C. </li><li> Transfert des cellules provenant de puits en tubes de 15 ml, ajouter 3 volumes de milieu de culture cellulaire goût suivis par centrifugation à 3000 rpm pendant 5 minutes à tempérament chambrerature. </li><li> Supprimer des cellules du surnageant et remettre en suspension avec 1 ml de milieu de cellules gustatives. </li></ol> 4. Propagation de cellules fongiformes homme papilles gustatives <ol><li> Transfert des cellules en T25 assiette et ajouter 4 ml de milieu cellules gustatives (passage 0). Maintenir les cellules à 36 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2. </li><li> Remplacer 1/3 de tous les moyens de 6-7 jours jusqu&#39;à ce que les cellules gustatives culture ont atteint 100% de confluence. A cette époque, pour permettre aux cellules gustatives à la récolte, laver les cellules une fois avec du PBS stérile, puis trypsiniser cellules en utilisant 0,25% p / v de trypsine / EDTA pendant 2-3 minutes à 36 ° C. </li><li> Après centrifugation, comme décrit ci-dessus, remettre en suspension dans un milieu de goût cellule complète et les cellules de transfert de frais flacons T-75 (passage 1). </li><li> Remplacer 1/3 de tous les moyens de 6-7 jours. Ne changez pas le plus souvent à moyen et / ou complètement. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.3 et 4.4 lorsque les cellules ont atteint près de 100% de confluence. Fractionner les cellules à pas plus que la dilution 1:4 dans un flacon T75suffisante pour maintenir la croissance des cellules dans le temps. </li></ol> 5. Le gel et le dégel de culture de l&#39;homme des cellules fongiformes goût papilles <ol><li> Pour congeler des stocks de cellules gustatives primaires, après trypsinisation (étape 4.2), ajouter 3 ml de milieu complet cellules gustatives et des cellules de transfert aux stériles tubes de 15 ml à centrifuger coniques. Centrifuger à 2500 rpm pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirez délicatement les cellules surnageantes et Resuspendre doucement avec un volume approprié de milieu de congélation contenant 95% sérum de veau fœtal (FBS) et 5% de DMSO. </li><li> Transfert cellules étiquetées, stérile cryotubes, fermer hermétiquement, et placer dans un récipient contenant de l&#39;isopropanol de congélation. Placer dans un congélateur à -80 ° C pendant au moins un jour avant de transférer indéfiniment à l&#39;azote liquide. </li><li> Pour décongeler un flacon de surgelés cellules primaires humaines fongiformes papilles gustatives, le lieu à 37 ° C bain-marie jusqu&#39;à ce que tout décongelé (environ 1 minute), tout en travaillant dans une culture cellulaire à flux laminairehotte. </li><li> Transfert cellules et le milieu de congélation à une tube de 15 ml stérile à centrifuger conique et ajouter 5 ml de milieu de culture cellulaire goût. </li><li> Centrifuger les cellules à 2500 rpm pendant 5 min à température ambiante. Eliminer délicatement le surnageant, les cellules Resuspendre doucement avec le milieu de culture complet goût cellule, et le transfert à un stérile T-25 flacon de culture tissulaire. </li><li> Continuer à cultiver des cellules selon l&#39;une étape 3 à 4. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Les tentatives visant à pousser les biopsies goût de la culture ont réussi 90% du temps. Quelques jours après la biopsie et de la dissociation, les cellules généralement commencé à croître et migrer vers l&#39;extérieur à partir des morceaux de tissu fongiformes disséqué qui sont restés après la procédure de dissociation. Bien que les cellules individuelles étaient visibles 24-48 heures après le placage (figure 1A), les cellules ont augmenté pour un maximum de 2-3 semaines dans des amas de cellules jointes, à l&#39;occasion de générer des cellules filles (figure 1B). De biopsie4-8 ING humaine fongiformes papilles, isolats initiaux de cellules primaires humaines fongiformes papilles gustatives atteignent environ 2000 - 8000 cellules dans 4 semaines de culture. Expansion dans des flacons T25 de culture cellulaire (passage 0) pour 3-4 semaines supplémentaires se traduira par des cellules humaines ayant fongiformes goût papilles dans la culture adaptée (figure 1C). Primaires des cellules fongiformes goût papilles peut être élargi à la culture pour donner vers le haut d&#39;au moins un million de cellules par passage-1 en 3-4 semaines (figure 1D). Cellules gustatives primaires va continuer à croître pendant plus de 8 passages. La morphologie des cellules en culture fongiformes homme papilles gustatives de la culture était similaire à des cultures de cellules chimiosensoriels décrit précédemment 11,12 .. La plupart des cellules humaines en culture fongiformes goût papilles ont maintenu leur aspect d&#39;origine compacte de corps cellulaires avec ou sans un ou plusieurs processus jusqu&#39;à 15-30 jours. Après avoir atteint la confluence de la culture la plus CElls avaient une apparence polarisée-allongée. Cellules gustatives adultes se composent de plusieurs différents sous-types histologiques et caractéristiques gustatives d&#39;exposition de cellules spécifiques. Ici, nous montrons que les cellules au sein de ces cultures présentent plusieurs caractéristiques moléculaires et physiologiques caractéristiques des cellules gustatives matures. Gustducin et la phospholipase C - β2, (PLC-β2) ARNm ont été détectés par réaction en chaîne de la transcriptase inverse-polymérase et des produits confirmés par séquençage (figure 2). Expression de gustducin et PLC-β2 a été détectée par immunocytochimie indiquant la présence de type II comme-cellules (figure 3 B et D, respectivement). La prévalence et les modes d&#39;expression relatifs de gustducin et PLC-β2 reflétant voies de signalisation cellulaire et des types de cellules ne reflète pas précisément celle observée in vivo. Les facteurs qui régissent la répartition relative des différents types de cellules au sein d&#39;un bourgeon du goût ne sont pas connus, et ne peut être reproduit dans des conditions de culture. Par conséquent, b<html> Oth les similitudes et les différences entre les cellules en culture et leur homologues dans les in vivo fournissent l&#39;occasion d&#39;examiner la réglementation de ces caractéristiques à un niveau moléculaire, dans des conditions qui peuvent être manipulés et contrôlés. Un critère important pour un système modèle est la présence de propriétés fonctionnelles pertinentes. Les cellules cultivées également présenté des augmentations robustes en calcium intracellulaire en réponse à des concentrations appropriées de stimuli gustatifs plusieurs (figure 4). Dans ces études, les stimuli douces et amères provoquer une augmentation du calcium intracellulaire qui peut correspondre à une dépolarisation. Ces cellules, comme le goût des propriétés des cellules cultivées apporter un soutien à l&#39;affirmation que le système modèle que nous décrivons ici sera un atout précieux pour poursuivre des études des voies de transduction et la capacité régénératrice des cellules gustatives de l&#39;homme. fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Attachement et la morphologie des cellules cultivées fongiformes homme papilles gustatives. Primaires de l&#39;homme fongiformes cultures cellulaires goût papilles cultivées sur des plaques de collagène de type 1 enrobés ont été imagées au bout de 2 jours (a). Les cellules fongiformes papilles gustatives ont augmenté pour un maximum de 4 semaines sous des amas de cellules attachées, qui semblaient donner lieu à des cellules filles. Les cellules généralement augmenté au confluent dans les quatre semaines (B), et (C et D) représente le jour 2 et 4 semaines après la récolte et le réensemencement, respectivement. Les cellules cultivées ont continué à croître pendant au moins 8 mois. Barres d&#39;échelle = 50 nm. Une partie de la figure 1 a également été présenté dans Özdener et. al. 10. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3730/3730fig2.jpg" /> Figure 2. RT-PCR résultats ont démontré la présence d&#39;ARNm spécifiques de biomarqueurs cellulaires goût (gustducin et PLC-β2,). L&#39;ARN total à partir de cultures de cellules fongiformes de l&#39;homme était transc inverseribed utilisant l&#39;exposant d&#39;abord Système de synthèse de brin pour la RT-PCR (Invitrogen) et utilisé pour la PCR par amplification avec des amorces spécifiques conçus pour la détection de gustducin et PLC-β2. Primaires (Tableau 1) ont été choisis pour couvrir un ou plusieurs introns. Chaque ARNm a été détecté dans des cultures de cellules humaines fongiformes papilles gustatives de passage 4 ou 5 avec des produits d&#39;amplification de la taille attendue, a confirmé par séquençage. ARNm spécifique n&#39;a été détecté dans des expériences de contrôle sans transcriptase inverse indiquant l&#39;absence de contamination de l&#39;ADN génomique. Les produits de PCR ont été séparés sur gels d&#39;agarose 2% et les produits amplifiés sur le gel ont été excisées avec un rasoir. L&#39;ADN a été extrait du gel en utilisant QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Les produits de PCR ont été séquencés à l&#39;Université de Pennsylvanie installations de séquençage. C-PCR et RT-C sont des expériences de contrôle pour la PCR et la transcriptase inverse, respectivement. Une partie de la figure 2 a également été présenté dans Özdener et. Al. <sup&gt; 10. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3730/3730fig3.jpg" /> Figure 3. Immunomarquage de la culture fongiformes papilles passage les cellules humaines goût 4 ou 5 ont montré la présence de biomarqueurs cellulaires goût. De culture des cellules humaines fongiformes goût papilles (5 jours) ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4%, et incubées avec des anticorps primaires (tableau 2) une nuit à 4 ° C. Les images ont été acquises avec un Leica TCS-SP2 microscope confocal à balayage laser. Environ, 60% des cellules en culture fongiformes papilles gustatives ont été marqués avec gustducin (B) et de 20-30% avec le PLC-β2 (D). Images de transmission de cellules correspondantes sont représentées (A et C). Pour les contrôles, immunomarquage avec un anticorps spécifique d&#39;immunoglobuline a démontré l&#39;absence d&#39;immuno réactivité non spécifique (données non présentées). Barres d&#39;échelle = 50 nm. Partiede la figure 3 a également été présenté dans Özdener et. al. 10. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3730/3730fig4.jpg" /> Figure 4. De culture des cellules humaines fongiformes goût papilles de passage 4 ou 5 répondre à différents stimuli. De culture des cellules humaines fongiformes goût papilles (4-5 jours) ont été chargées avec 1 mM Fura-2 AM (Molecular Probes) et 10 mg / ml Pluronic F127 (Molecular Probes). Changements dans les niveaux de calcium intracellulaire ([Ca 2 +] i) dans des cellules cultivées fongiformes homme papilles gustatives ont été mesurés en utilisant des techniques d&#39;imagerie manuelles. Les cellules ont été visualisés à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé à fluorescence à des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation de 340 nm et 380 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission fixée par un filtre passe-bande centré à 510 nm. Les stimuli ont été dissous dans une solution de bain, puis le pH et l&#39;osmolarité réajusté si nécessaire. De culture des cellules humaines fongiformes goût papilles répondu aux stimuli douces et amères. GGRAPHIQUES illustrer les réponses représentatives de [Ca +2] i les niveaux dans des cellules individuelles pendant l&#39;exposition à (A) dénatonium (2 mM), (B) Le sucralose (1 mM). Chaque trace représente simples cellules individuelles. <table border="1"><tbody><tr><td> Gène </td><td> Séquence </td><td colspan="2"> État PCR </td><td> La taille prévue (Pb) </td><td> Référence </td></tr><tr><td> β-actine </td><td> GGACTTCGAGCAAGAGATGG AGCACTGTGTTGGCGTACAG </td><td> 7 min 45 sec 45 sec 45 sec 7 min </td><td> 95 94 53 72 72 </td><td> 234 </td><td> NM_001101.3 </td></tr><tr><td> Gustducin </td><td> TCTGGGTATGTGCCAAATGA GGCCCAGTGTATTCTGGAAA </td><td> 7 min 45 sec 45 sec 45 sec 7 min </td><td> 95 94 53 72 72 </td><td> 386 </td><td> NM_001102386 </td></tr><tr><td> PLC-β2 </td><td> GTCACCTGAAGGCATGGTCT TTAAAGGCGCTTTCTGCAAT </td><td> 3 min 30 sec 30 sec 60 sec 7 min </td><td> 95 94 53 72 72 </td><td> 333 </td><td> NM_004573 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Les amorces et les conditions utilisées pour la détection de molécules gustatives spécifiques. <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps primaire </td><td> Source </td><td> Hôte </td><td> Dilution </td><td> Anticorps secondaire </td><td> Source </td><td> Hôte </td&gt; <td> Dilution </td></tr><tr><td> Gustducin </td><td> Santacruz </td><td> Lapin </td><td> 1:500 </td><td> Anti-IgG de lapin Alexa 633 </td><td> Molecular Probes </td><td> Chèvre </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> PLC-β 2 </td><td> Santacruz </td><td> Lapin </td><td> 1:500 </td><td> Anti-IgG de lapin Alexa 633 </td><td> Molecular Probes </td><td> Chèvre </td><td> 1:500 </td></tr></tbody></table> Anticorps Tableau 2. Utilisé pour détecter l&#39;expression de molécules spécifiques.

<ol>
	<li>Mbiene, J. P., Maccallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia.">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> J. Comp. Neurol. 377, 324-340 (1997).</li><li>Miyamoto, T., Fujiyama, R., Okada, Y., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+difference+in+amiloride-sensitivity+of+salt-induced+responses+in+mouse+non-dissociated+taste+cells.">Strain difference in amiloride-sensitivity of salt-induced responses in mouse non-dissociated taste cells.</a> Neurosci. Lett. 277, 13-16 (1999).</li><li>Caicedo, A., Jafri, M. S., Roper, S. 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G., Michaels, R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+odorant+elicited+calcium+changes+in+cultured+human+olfactory+neurons.">Characteristics of odorant elicited calcium changes in cultured human olfactory neurons.</a> J. Neurosci. Res. 62, 737-749 (2000).</li><li>Wolozin, B., Sunderland, T., Zheng, B. B., Resau, J., Dufy, B., Barker, J., Swerdlow, R., Coon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+neuronal+cells+from+adult+human+olfactory+epithelium.">Continuous culture of neuronal cells from adult human olfactory epithelium.</a> J. Mol. Neurosci. 3, 137-146 (1992).</li><li>Wick, N., Saharinen, P., Saharinen, J., Gurnhofer, E., Steiner, C. W., Raab, I., Stokic, D., Giovanoli, P., Buchsbaum, S., Burchard, A., Thurner, S., Alitalo, K., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomal+comparison+of+human+dermal+lymphatic+endothelial+cells+ex+vivo+and+in+vitro.">Transcriptomal comparison of human dermal lymphatic endothelial cells ex vivo and in vitro.</a> Physiol. Genomics. 17, 179-192 (2007).</li><li>Fu, L., Zhu, L., Huang, Y., Lee, T. D., Forman, S. J., Shih, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+neural+stem+cells+from+mesenchymal+stemcells:+evidence+for+a+bipotential+stem+cell+population.">Derivation of neural stem cells from mesenchymal stemcells: evidence for a bipotential stem cell population.</a> Stem Cells Dev. 17, 1109-1121 (2008).</li><li>Sandow, S. L., Grayson, T. 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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous avons maintenu les cellules obtenues à partir de papilles fongiformes goût humain depuis plus de 8 passages, couvrant une période de 12 mois. Ces cultures de générer de nouvelles cellules, dont beaucoup viennent à échéance in vitro à l&#39;étape où ils expriment des marqueurs de plusieurs types de cellules matures goût de bourgeon, en plus de clés propriétés moléculaires et physiologiques de cellules réceptrices du goût. La présence de gustducin et PLC-β2 immunoréactivité en sous-ense...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td></tr><tr><td> MCDB 123 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Iscove milieu DMEM </td><td> MediaTech </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> Worthington </td></tr><tr><td> Huile de soja inhibiteur de la trypsine </td><td> Worthington </td></tr><tr><td> La collagénase de type 1 </td><td> Worthington </td></tr><tr><td> Collagène de type 1 queue de rat </td><td> Sciences BD </td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Molecular Probes </td></tr><tr><td> Exposant le premier système de synthèse de brin pour la RT-PCR </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Leica TCS SP2 spectrale Microscope confocal </td><td> Leica Microsystems Inc </td&gt; </tr><tr><td> Discovery-1 d&#39;imagerie et de la station Metamorph logiciels </td><td> Molecular Devices </td></tr><tr><td> Les petites à pointe fine pince et ciseaux supplémentaires beau printemps </td><td> Outils belle science </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of human fungiform taste papillae cells

Cellules gustatives sont très spécialisées, avec uniques histologiques, les caractéristiques moléculaires et physiologiques qui permettent la détection d&#39;un large éventail de stimuli simples et molécules chimiques complexes contenus dans les aliments. Chez l&#39;homme, fongiformes papilles individuelle contenir de zéro à un maximum de 20 papilles gustatives. Il n&#39;ya pas de protocole établi pour la culture de cellules gustatives de l&#39;homme, bien que la capacité à maintenir les cellules papilles gustatives de la culture pour les cycles cellulaires multiples serait d&#39;une utilité considérable pour caractériser les propriétés moléculaires, de régénération, et fonctionnelles de ces cellules uniques sensoriels. Des études antérieures de cellules gustatives ont été effectuées en utilisant des cellules isolées fraîchement en culture primaire, des cultures d&#39;explants de rongeurs, ou papilles semi-intactes dans des tranches de tissu 1,2,3,4. Bien que chacune de ces préparations a des avantages, le développement de cultures à long terme aurait apporté des avantages significatifs, en particulier pour les études de cellules gustatives prolifération et différenciation. Plusieurs groupes, dont le nôtre, ont été intéressés par le développement et la mise en place de modèles de culture de cellules gustatives. La plupart des tentatives de cellules gustatives de la culture ont rapporté la viabilité limitée, avec des cellules généralement pas durables au-delà de 3-5 D 5,6,7,8. Nous avons récemment présenté un rapport sur ​​une méthode efficace pour la culture prolongée des cellules gustatives rongeurs 9. Nous rapportons ici pour la première fois la mise en place d&#39;un système de culture in vitro pour les cellules isolées de l&#39;homme fongiformes papilles gustatives. Les cellules de l&#39;homme fongiformes papilles obtenus par biopsie ont été avec succès maintenues en culture pendant plus de huit passages (12 mois) sans perte de viabilité. Cellules affiché de nombreuses fonctionnalités moléculaires et physiologiques caractéristiques des cellules gustatives matures. Gustducin et la phospholipase C β2, (PLC-β2) ARNm ont été détectés dans de nombreuses cellules par réaction en chaîne par polymérase de la transcriptase inverse-et confirmé par séquençage. Analyse Immunocytochimie démontré la présence de rafales deexpression ducin et PLC-β2 dans les cellules gustatives culture. Des cultures de cellules humaines fongiformes également présenté des augmentations de calcium intracellulaire en réponse à des concentrations appropriées de stimuli gustatifs indiquant que plusieurs récepteurs du goût et au moins certains des voies de signalisation étaient présents. Ces résultats indiquent que suffisante cellules gustatives de l&#39;homme adulte peut être générée et maintenue pendant au moins huit passages. Bon nombre des cellules conservent les caractéristiques physiologiques et biochimiques des cellules isolés de manière aiguë à partir de l&#39;épithélium goût des adultes pour soutenir leur utilisation comme un système modèle de goût. Ce système permettra à d&#39;autres études des processus impliqués dans la prolifération, la différenciation et la fonction de mammifères cellules réceptrices du goût dans une préparation in vitro. Human papilles gustatives fongiformes utilisé pour établir une culture cellulaire humaine fongiformes ont été donnés pour la recherche après consentement éclairé appropriée en vertu des protocoles de recherche qui ont été examinéset approuvé par le comité de la CISR. Le protocole (# 0934) a été approuvé par les Associés Schulman Institutional Review Board Inc, Cincinnati, OH. Protocole écrit ci-dessous est basée sur des paramètres publiés rapportés par Özdener et al. 2011 10.

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Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Nous avons cherché à élaborer un protocole reproductible pour isoler et de maintenir à long terme des cultures de cellules humaines fongiformes papilles gustatives. Les cellules de l&#39;homme fongiformes papilles obtenus par biopsie ont été avec succès maintenues en culture pendant plus de huit passages (12 mois) sans perte de viabilité.

Isolement et culture de cellules humaines fongiformes papilles gustatives

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

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Neuroscience

14.3K vues.  Monell Chemical Senses Center. Nous avons cherché à élaborer un protocole reproductible pour isoler et de maintenir à long terme des cultures de cellules humaines fongiformes papilles gustatives. Les cellules de l'homme fongiformes papilles obtenus par biopsie ont été avec succès maintenues en culture pendant plus de huit passages (12 mois) sans perte de viabilité.

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Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Isolement et culture des cellules souches neurales Crête des follicules pileux humains

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Recherche

Neurosciences

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in glioblastoma mutliforme (GBM), is to identify and isolate tumor initiating cell population(s) to investigate their role in tumor formation, progression, and recurrence. Understanding tumor initiating cell populations will provide clues to finding effective therapeutic approaches for these tumors. The neurosphere assay (NSA) due to its simplicity and reproducibility has been used as the method of choice for isolation and propagation of many of this tumor cells. This protocol demonstrates the neurosphere culture method to isolate and expand stem-like cells in surgically resected human GBM tumor tissue. The procedures include an initial chemical digestion and mechanical dissociation of tumor tissue, and subsequently plating the resulting single cell suspension in NSA culture. After 7-10 days, primary neurospheres of 150-200 &mu;m in diameter can be observed and are ready for further passaging and expansion.

This video protocol demonstrates the isolation and expansion of stem like cells from surgically resected human glioblastoma mutliforme (GBM) tumor tissue using the neurosphere assay culture method.

L&#39;isolement et l&#39;expansion des cellules humaines de glioblastome multiforme tumeur utilisant le test Neurosphère

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Isolement et culture de cellules embryonnaires de rat neurones: un protocole rapide

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolement et culture des astrocytes corticaux de souris

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potentiel de membrane Dye Imaging de ventromédian hypothalamus neurones de souris adulte à étudier Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

Denver Protocole Papilles pour analyse objective des papilles fongiformes

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolement et culture des adultes cellules souches neurales de la Subcallosal Zone Souris

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.