Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire du Dr Keji Zhao (NIH / NHLBI) pour leur aide dans la fourniture de résultats de séquençage. Nous aimerions également remercier le projet du génome UCSC pour l&#39;utilisation de Genome Browser pour visualiser séquençage cartographié lit. Ce travail a été soutenu par le Sentier de la R00HD055052 NIH pour Independence Award et R01HD065816 du NICHD, l&#39;Lucile Parkard Fondation, et l&#39;Université Johns Hopkins des fonds de démarrage pour XC

(La procédure puce entière prend environ deux jours. Préparation des bibliothèques de puces pour séquençage à haut débit prend un autre 2-3 jours.) 1. Disséquer et préparer les tissus pour l&#39;expérience ChIP (~ 1 million de cellules) <ol><li> Disséquer les tissus d&#39;intérêt (par exemple 200 paires de Drosophila testicules) dans du PBS froid + inhibiteur de la protéase 1x (dissoudre 1 pastille de cocktail d&#39;inhibiteurs de protéase dans 1,5 ml de PBS 1x pour obtenir une solution stock de 7x) + PMSF (concentration finale 100 pg / mL). Rincer le tissu deux fois et remettre en suspension des tissus dans 200 ul de la même solution PBS avec des inhibiteurs. </li><li> Pour fixer l&#39;échantillon, ajouter 5,5 pi formaldéhyde 37% (formaldéhyde chaud en bain à 37 ° C eau pendant 1 min avant utilisation). Incuber à 37 ° C pendant 15 minutes, vortex toutes les 5 minutes entre les deux. </li><li> Placer l&#39;échantillon sur la glace pour que le tissu reposer pendant 2 minutes. Rincer 2 fois avec 450 ul de PBS (avec les inhibiteurs de protéase et PMSF). L&#39;échantillon peut maintenant être magasind à -20 ° C. Répéter plusieurs fois la dissection plusieurs pour obtenir suffisamment de matériel pour ChIP. </li></ol> 2. Préparer surnageant avec la protéine-ADN Conjugaison pour dosage ChIP <ol><li> Mélanger l&#39;échantillon suffisamment de l&#39;étape 1.3 dans un tube 1,75 ml Eppendorf. </li><li> Retirez du PBS à partir échantillon de tissu. Ajouter 200 ul de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM de CaCl2, 0,2% de Triton X-100 ou NP-40, 5 mM de butyrate, et 1x cocktail inhibiteur de protéinase). Ajouter une nouvelle solution de stock PMSF à un tampon de lyse (PMSF concentration finale de 0,5 mM). Homogénéiser avec le bleu homogénéisateur (Cat # 749521-1590 Fisher) jusqu&#39;à ce que les tissus se dissocient complètement sans agrégation, incuber à température ambiante (température ambiante) pendant 10 minutes. </li><li> Sonication: sonicateur micropointe utilisation (Misonix HS-XL200) à la puissance 20. Soniquer pendant 10 sec et le reste sur la glace pendant 50 sec. Répétez 4-5 fois (temps de sonication optimale doit être déterminée de manière empirique, que plus sonication donnera des fragments plus petits. Pour ChIP utilisant des anticorps contre Histonmodifications e, nous avons l&#39;habitude soniquer chromatine à environ 200-300 pb, car le facteur de transcription régulateur de la chromatine ou (par exemple des protéines Polycomb), nous avons l&#39;habitude soniquer chromatine au 200-1000 pb. Cependant, la taille des fragments optimale devrait être testée empiriquement. Remarque: TOUJOURS GARDER LE TUBE ON ICE MEME PENDANT sonication EXEMPLE POUR ÉVITER DE CHAUFFE! </li><li> Diluer l&#39;échantillon en ajoutant 1,8 ml tampon RIPA (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, EDTA 1 mM, SDS 0,1%, 0,1% de Na-désoxycholate, 1% de Triton X-100, avec des inhibiteurs de protéase et PMSF à la concentration identique à celle décrite précédemment). Enregistrer 40 ul comme entrée de commande en ajoutant 2 ul NaCl 5M et incuber à 65 ° C pendant la nuit (O / N) pour inverser réticulation. </li><li> Pour conjuguer l&#39;anticorps à des billes, ajouter 40 ul de protéines A perles dans un tube eppendorf de 1,5 ml, puis ajouter 600 ul de PBS et le rock à 4 ° C pendant 2 minutes, appliquer des perles à l&#39;aimant et enlever le surnageant. Ajouter 100 ul de PBS et l&#39;anticorps d&#39;intérêt (quantité d&#39;anticorps doit être déterminée empiquement). Incuber à température ambiante pendant 1 heure ou 4 ° C pendant 4 heures. </li><li> Enlever le surnageant à partir de perles par aimant et ajouter l&#39;extrait de chromatine 1mL de l&#39;étape 2.4 aux perles. Tourner à 4 ° CO / N. </li><li> Appliquer l&#39;échantillon ChIP à l&#39;aimant et enlever le surnageant. Laver les billes avec le tampon suivant à 4 ° C pendant 10 minutes chacune: 2x avec 1 ml de tampon RIPA [1.89 ml &quot;tampon RIPA &#39;+ 315 ul inhibiteurs de la protéase 7x + 20 uL PMSF]; 2x avec 1 ml de tampon RIPA + 0,3 M de NaCl [1.89 ml tampon RIPA + 220 pi 3 M de NaCl]; 2x avec 1 ml de tampon LiCl (0,25 M LiCl, 0,5% NP40, 0,5% NaDOC); 1x avec 1 ml de TE 1x + 0,2% de Triton X-100; 1x avec 1 ml de TE 1x. </li><li> Pour inverser réticulation, remettre en suspension les perles dans 100 pi de tampon TE + 3 pl SDS à 10% + 5 ul de protéinase K (20 mg / mL). Incuber à 65 ° CO / N. </li><li> Appliquer des perles à l&#39;aimant et de transférer le surnageant dans un nouveau tube. Le surnageant contient votre échantillon d&#39;ADN. Laver perles avec 100 ul de TE + 0,5 MNaCl et combiner le surnageant deux. </li><li> Phénol-chloroforme extraction de l&#39;échantillon d&#39;ADN. Ajouter 200 ul de phénol: Chlorofrom: IAA (25/24/1) mélange et le vortex. Centrifuger à 14k pendant 5 minutes à température ambiante. Alternativement, l&#39;ADN peut être extrait en utilisant le kit Qiagen PCR purification. </li><li> Transférer le surnageant / aqueuse dans un nouveau tube, et ajouter l&#39;acrylamide linéaire pour une concentration finale de 20 pg / ml (variante 1 ul de glycogène à 20 mg / ml pour chaque 1 mL de surnageant peut également être utilisé. Le glycogène est utilisé pour qPCR ultérieure ou des analyses PCR en acrylamide linéaire est utilisée pour le séquençage des tests.) Ajouter 20 uL de 3M NaOAc et 500 ul EtOH 100%. Bien mélanger et incuber à 80 ° C pendant 10 minutes. Centrifuger à vitesse maximale pendant 20 minutes à 4 ° C. </li><li> Enlever le surnageant et laver avec 300 EtOH 70% ul. Échantillon d&#39;air sec et remettre en suspension dans 50 pl de tampon TE. Exemple peuvent désormais être stockés à -20 ° C. L&#39;échantillon peut être utilisé pour la PCR quantitative (qPCR) test (Figure 1). </li></ol> 3a. Analyser ChIP-ed ADN en utilisant qPCR <ol><li> Diluer l&#39;ADN génomique à la concentration ci-dessous pour faire une courbe standard: non dilué, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000. </li><li> Pour chaque paire d&#39;amorces, mis en place qPCR en double exemplaire en une plaque de 96 puits avec de l&#39;ADN génomique à partir de 3a.1 étapes, le contrôle d&#39;entrée et ChIP-ed ADN: 10 uL 2x SYBR mélange PCR (Fermentas, K0222); 1 pl 10 uM Amorce; 1 ul 10 amorce inverse uM; x ul ChIP-ed ADN (contrôle d&#39;entrée, ou de l&#39;ADN génomique); y ul sans nucléase H 2 O pour régler le volume de réaction à 20 pi. </li><li> Centrifuger la plaque de 96 puits avec Mini plaque de spinner (Labnet). </li><li> Effectuer qPCR avec ABI 7300 PCR en temps réel du système (ou d&#39;autres systèmes en temps réel PCR) en utilisant la condition suivante: Étape 1: 50 ° C pendant 2 min, 1 cycle; Etape 2: 95 ° C pendant 10 min, 1 cycle; Etape 3: 95 ° C pendant 15 s, à 60 ° C pendant 1 min, 40 cycles; Etape 4 (étape de dissociation): 95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 1 min, 95 ° C pendant 15 s. </li><li> Vérifiez la courbe de dissociation: un pic à la parcelle de dissociation thermique suggère un amplicon unique à partir de la réaction de PCR. Plus d&#39;un pic indique non spécifique produit avec la paire d&#39;amorces, les données qPCR doit pas être utilisé. </li><li> Déterminer la phase linéaire de l&#39;amplification exponentielle de la réaction PCR pour chaque jeu d&#39;amorces, en calculant la formule qui résout quantité d&#39;ADN selon l&#39;Ct (cycle seuil) de valeur, qui est basée sur la courbe d&#39;étalonnage en utilisant la série de l&#39;ADN génomique dilué dans 3a. 1. </li><li> Si la valeur de Ct ChIP-ed ADN et de commande d&#39;entrée sont dans la plage linéaire de la valeur Ct, calculer l&#39;enrichissement de l&#39;ADN ChIP-ed par rapport entrée, selon le facteur de dilution d&#39;ChIP-ed ADN et de commande d&#39;entrée en 2,4. </li></ol> 3b. Amplifier ChIP-ed ADN pour le séquençage à haut débit. <ol><li> Fin de la réparation de ChIP-ed mélange d&#39;ADN (UtilisezEpicentre d&#39;ADN FIN-kit de réparation), mis en place sur la glace: 1-34 ADN génomique ul de l&#39;étape 2.12 (0.1 à 5 mg) 5 ul de tampon 10x réparation Fin 5 pl 2,5 mM dNTP mix 5 pi 10 mM ATP x pi H 2 O pour régler le volume de réaction à 49 pl 1 mix ul Enzyme Fin-Réparation (ADN polymérase T4 + T4 polynucléotide kinase) Incuber pendant 45 minutes à température ambiante. Purifier réaction à l&#39;aide Qiagen MinElute réaction Kit de nettoyage. Eluer dans 30 ul tampon d&#39;élution (EB). </li><li> Ajouter A surplombe les à l&#39;extrémité 3 &#39;: 30 ul du produit de l&#39;ADN élué 3b.1 étape 5 pi de tampon NEB 10x n ° 2 10 pi 1 mM dATP 2 pl dH 2 O 3 pi 5 Fragment de Klenow U / pl (3 &#39;→ 5&#39; exo-) Incuber pendant 30 minutes à 37 ° C. Purifier réaction à l&#39;aide MinElute ReactionCleanup kit. Eluer dans 10 EB ul. </li><li> Solexa ligature linker: 10 pl de l&#39;ADN élué à partir 3b.2 étape 10 ul ddH 2 O 2.5 &amp;mu; l 10x tampon T4 DNA ligase 1 Adaptateur ul mélange oligo d&#39;Illumina (1/10-diluted de stock) 2,5 pl ligase d&#39;ADN T4 (400 unités / pl) Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Purifier réaction à l&#39;aide MinElute ReactionCleanup kit. Eluer dans 20 EB pl. Exemple peuvent désormais être stockés à -20 ° C. </li><li> Exécutez l&#39;échantillon d&#39;ADN élué à partir 3b.3 étape en utilisant l&#39;appareil E-gel. Isoler la bande 300-500 pb dans le gel et purifier en utilisant le kit Qiagen Gel Extraction (cette étape permet d&#39;éliminer les 125 pb de ~ auto-ligaturés linkers de la ligature adaptateur oligo). Eluer dans 12 EB pl. </li><li> Amplification de la bibliothèque en utilisant jumelé-end (PE) amorces d&#39;Illumina: 10,5 ul de l&#39;ADN élué à partir 3b.4 étape 12,5 ul de mélange maître (2X Phusion HF, Finnzymes) 1 pl de PE1 PCR amorce 1 1 pl de PE2 PCR amorce 2 État PCR: 98 ° C pendant 30 sec (98 ° C 10 Sec, 65 ° C 30 Sec, 72 ° C 30 s), répètent 20 cycles 72 ° C pendant 5 minutes. </li><li> Les échantillons provenant de 3b.5 étape peut être utilisé pour ChIP-seq après avoir sélectionné l&#39;ADN de taille appropriée (300-500 pb) en utilisant la norme de 2% gel d&#39;agarose. Exemple peuvent désormais être stockés à -20 ° C. Il est préférable d&#39;isoler chaque échantillon ChIP sur un seul gel pour éviter la contamination. Les échantillons peuvent être soumis à l&#39;séquençage à haut débit. </li></ol> 3c. Analyse du pipeline Solexa <ol><li> Le séquençage de 25 pb lit ont été obtenus à partir de l&#39;Analyseur de Illumina Genome (GA) de pipeline. </li><li> Toutes les lectures ont été alignés sur le génome de la Drosophile (dm3) en utilisant le ELAND (Efficient alignement local de données de nucléotides) de logiciels, permettant jusqu&#39;à deux mésappariements avec la séquence de référence. </li><li> Lectures unique cartographiés ont été retenus pour l&#39;analyse en aval. Pour de multiples lectures identiques, jusqu&#39;à trois exemplaires ont été retenus pour réduire la possibilité de biais de l&#39;amplification par PCR. </li><li> La sortie du pipeline GA a été converti en données extensibles navigateur (BED) de fichiers. </li><li> Pour générerles fichiers perruque pour télécharger le navigateur UCSC pour la visualisation, nous avons utilisé un scrip python qui a été décrit dans une publication précédente 3 avec 4 pb que la taille de la fenêtre et 160 pb que la taille des fragments d&#39;ADN. </li><li> Pour classer les gènes chez la drosophile dans les gènes silencieux et exprimé, nous avons utilisé un certain nombre numérique appelé RPKM (lit / par kilobase fusionné région exonique / par million mappé lit). Les gènes avec RPKM = 0 ont été classés dans le groupe silencieux et des gènes avec RPKM ≥ 1 ont été classés dans les groupes exprimées, qui peuvent être classées en trois sous-groupes comme les gènes avec une faible expression, modérée et élevée, et chaque groupe dispose d&#39;environ le même nombre de gènes. </li><li> Pour comparer le niveau de modification des histones et l&#39;expression des gènes, nous avons utilisé un script python qui a été décrit dans un 3 publication précédente. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Des exemples de ChIP-qPCR résultats en utilisant BAM (sac de billes) mutant<html> testicules sont représentés à la figure 1 4. En bam testicules, il ya un échec dans la transition de spermatogonies proliférative à la différenciation des spermatocytes 5, 6. Nous utilisons bam testicules comme une source de cellules germinales indifférenciées, qui sont enrichis dans ce type de tissu. Gènes de différenciation nécessaire à la différenciation du sperme, comme facteur de transcription spécifique des hommes 87 (mst87F), Don Juan (dj), et l&#39;oignon floue (FZO) ne sont pas exprimés en bam testicules. Ces gènes sont hautement enrichi avec la répression H3K27me3 modification des histones 7 (figure 1A), mais sont dépourvus de la population active H3K4me3 modification des histones 8 (figure 1B), une signature que nous avons appelé chromatine «monovalent» 7. Enrichissement de l&#39;une des H3K27me3 ou H3K4me3 est déterminée par la normalisation à une cycline constitutivement exprimé un gène (Cyca) 4. contenu &quot;&gt; ChIP-seq analyse en utilisant le même ensemble d&#39;anticorps (c.-à-répressive H3K27me3 et H3K4me3 active) avec bam testicules mutants (Figure 2) a validé les résultats de qPCR de la figure 1. Pour les trois gènes testés différenciation terminale mst87F, dj et FZO , leurs régions génomiques sont hautement enrichi avec H3K27me3 mais pas H3K4me3 (Figure 2A à 2C). En revanche, le gène exprimé de façon constitutive Cyca a H3K4me3 significatif mais peu contraignante H3K27me3 à proximité de son site de départ de la transcription (TSS) (figure 2D). En outre, les profils de ChIP H3K27me3 et H3K4me3 près des TSS de quatre classes de gènes différentiellement exprimés sont compatibles avec la fonction de chaque modification des histones. Comme le montre la figure 3A, l&#39;enrichissement de H3K27me3 en aval de la TSS est inversement corrélée avec le niveau de l&#39;expression des gènes. Les gènes silencieux sont les plus H3K27me3 alors que legènes fortement exprimés n&#39;ont pas contraignant H3K27me3. Ces données sont cohérentes avec le rôle répressif de H3K27me3 sur l&#39;expression génique. En revanche, l&#39;enrichissement de H3K4me3 autour des TSS a montré la corrélation inverse avec le niveau de l&#39;expression des gènes (figure 3B), compatible avec le rôle actif de H3K4me3 sur l&#39;expression génique. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig1.jpg" /> Figure 1. Analyse qPCR de ChIP-ed ADN en utilisant un anticorps contre la répression soit H3K27me3 modification des histones (A) ou actif H3K4me3 modification des histones (B) dans enrichie en cellules indifférenciées bam testicules mutantes. (A) Dans les testicules, bam gènes de différenciation (Mst87F, dj, FZO) sont enrichis avec la modification des histones H3K27me3 répressive. (B) des gènes de différenciation sont épuisées avec H3K4me3 marque active. Le niveau de l&#39;ADN ChIP (puces à ADN / entrée) au niveau du gène cible (Mst87F, dj ou FZO) a d&#39;abord été normalisée à la lev<html> el de l&#39;ADN ChIP au niveau du gène de contrôle Cyca. Les barres d&#39;erreur indiquent l&#39;écart-type de trois indépendante biologique répétitions. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig2.jpg" /> Figure 2. Instantanés UCSC Genome Browser de H3K27me3 et H3K4me3 enrichissement à travers les régions entières de la génomique (A) Mst87F (B) dj et (C) FZO, (D) des gènes Cyca. Le cercle H3K27me3 enrichi région (D) reflète l&#39;état de la chromatine un gène qui se chevauchent CG7264, qui est humble exprimée en bam testicules (RPKM = 1), mais fortement exprimé dans les testicules de type sauvage (RPKM = 130) 8 (ChIP-seq données provenant de 7). Les sondes utilisées dans l&#39;analyse PCR quantitative des résultats ChIP de la figure 1 sont marqués au bas de chaque parcelle. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . tp_upload/3745/3745fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. ChIP-seq profils en utilisant H3K27me3 et H3K4me3 en bam testicules 7. Les quatre groupes de gènes (gènes 7,509) ont été classés en fonction de leurs niveaux d&#39;expression génique basée sur l&#39;ARN-seq résultats 8. Les classes représentatives de gènes sont tracées pour l&#39;enrichissement d&#39;une modification particulière des histones, en utilisant des séquences de 3kb en amont pour 3kb aval de leurs sites de début de transcription (TSS). Cela génère un profil de l&#39;enrichissement de (A) H3K27me3 (K27) et (B) H3K4me3 (K4) ChIP-seq analyses dans chaque groupe. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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	<li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster.">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li><li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells.">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li><li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li><li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage.">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li><li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis.">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li><li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles:+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis.">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li><li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis.">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li><li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq.">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

La polyvalence des analyses ChIP abordés dans le présent protocole peut être utilisé sur différents tissus, qui prévoit la possibilité d&#39;étudier l&#39;état de la chromatine dans un système biologiquement pertinentes. Expériences utilisant des cellules de ChIP systèmes de culture sont commodes à réaliser parce que grande quantité de cellules peut être facilement obtenu. Cependant, les cellules cultivées ne reflètent pas nécessairement les cellules dans un environnement multi-cellulaire. En dévelop...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Complete cocktail Mini inhibiteur de la protéase </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> Le formaldéhyde (37%) </td><td> Supelco </td><td> 47083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 78830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes culot pilon </td><td> Fischer Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de purification PCR </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Polyacrylamide linéaire </td><td> Sigma </td><td> 56575-1ML </td><td></td></tr><tr><td> Le glycogène </td><td> Qiagen </td><td> 158930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR green / ROX qPCR Master Mix </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> Mini plaque de spinner </td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> PCR en temps réel du système </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td> Processeur petit volume à ultrasons </td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td> Modèle interrompu </td></tr><tr><td> Dynabeads, la protéine A </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> Dynamag aimant </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> Phénol: Chlorofrom: IAA </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentre d&#39;ADN FIN-kit de réparation </td><td> Biotechnologies Epicentre </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute reactioKit de nettoyage n </td><td> Qiagen </td><td> 28204 </td><td></td></tr><tr><td> Fragment de Klenow (3 &#39;→ 5&#39; exo-) </td><td> New England Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> ADN ligase de T4 </td><td> Promega Corporation </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> Adaptateur oligonucléotides </td><td> Illumina </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Paired-End 1,0 et 2,0 </td><td> Illumina </td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> Système Electorphoresis E-Gel </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue

L&#39;épigénétique reste un domaine en développement rapide qui étudie la façon dont l&#39;Etat contribue à la chromatine expression différentielle des gènes dans des types cellulaires distincts à différents stades de développement. Régulation épigénétique contribue à un large éventail de processus biologiques, y compris la différenciation cellulaire au cours du développement embryonnaire et de l&#39;homéostasie à l&#39;âge adulte. Une stratégie essentielle dans les études épigénétiques est d&#39;examiner comment diverses modifications des histones et des facteurs de la chromatine réguler l&#39;expression génique. Pour résoudre ce problème, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est largement utilisé pour obtenir un instantané de l&#39;association de facteurs particuliers avec de l&#39;ADN dans les cellules d&#39;intérêt. Technique de ChIP utilise couramment des cellules en culture comme matériau de départ, qui peut être obtenu en abondance et d&#39;homogénéité pour générer des données reproductibles. Cependant, il ya plusieurs mises en garde: Tout d&#39;abord, l&#39;environnement de cultiver des cellules dans les boîtes de Pétri est différente de celle in vivo, ce qui peutreflète pas l&#39;état chromatine endogène des cellules dans un organisme vivant. Deuxièmement, tous les types de cellules peuvent être cultivées ex vivo. Il ya seulement un nombre limité de lignées cellulaires, à partir de laquelle les gens peuvent obtenir suffisamment de matériel pour le dosage ChIP. Nous décrivons ici une méthode pour faire l&#39;expérience en utilisant des tissus de Drosophila ChIP. Le matériau de départ est disséqué les tissus d&#39;un animal vivant, ce qui peut refléter l&#39;état chromatine endogène. L&#39;adaptabilité de cette méthode avec beaucoup de différents types de tissus permettra aux chercheurs de répondre beaucoup plus biologiquement questions pertinentes relatives à la régulation épigénétique in vivo 1, 2. En combinant cette méthode avec séquençage à haut débit (ChIP-seq) sera en outre permettre aux chercheurs d&#39;obtenir un paysage épigénomique.

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Récemment la technologie de séquençage à haut débit a considérablement augmenté la sensibilité de la chromatine immunoprécipitation (ChIP) expérience et son invité application à l&#39;aide des cellules purifiées ou de tissus disséqués. Ici, nous délimiter une méthode pour utiliser la technique ChIP avec<em&gt; Drosophila</emTissus&gt;, qui peut traiter de l&#39;état chromatine endogène dans un système bien caractérisé biologique.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) à l&#39;aide Drosophila Tissus

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

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Biology

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

25.0K vues.  Johns Hopkins University. Récemment la technologie de séquençage à haut débit a considérablement augmenté la sensibilité de la chromatine immunoprécipitation (ChIP) expérience et son invité application à l'aide des cellules purifiées ou de tissus disséqués. Ici, nous délimiter une méthode pour utiliser la technique ChIP avec Drosophila, qui peut traiter de l'état chromatine endogène dans un système bien caractérisé biologique.

Vidéo: Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Modélisation des cellules souches embryonnaires utilisant la puce Bio Retourner

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Recherche

Biologie

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

Un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Immunoprécipitation ADN méthylé

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines Activé

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Assay immunoprécipitation de la chromatine des gènes spécifiques de tissus en utilisant des embryons de souris en début de

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparaison quantitative des Cis-Regulatory Element (CRE) Activités dans transgéniques Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Immunoprécipitation de la chromatine efficace en utilisant des quantités limitées de biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l&#39;ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

L&#39;approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...