Bu yöntem, kistik fibrozis akciğer enfeksiyonlarında gördüğünüze benzer hücre fizyolojisini ve biyofilm morfolojisini tetikleyen bir ortamda bakteri yetiştirmenizi sağlar. Akciğerler et endüstrisinde atık bir ürün olduğu için etik kaygılar yok. Model, canlı bir hayvan modeline ihtiyaç duymadan insan enfeksiyonunu taklit etmek için bir platform sunar.
Bu teknik, araştırmacılara kistik fibrozis akciğerlerinde oluşan biyofilmlere girme ve yok etme potansiyeli için aday ilaçları taramanın yeni bir yolunu sunar. Daha fazla geliştirme ve doğrulama ile, EVPR modelinin özel ve bireyselleştirilmiş antibiyotik duyarlılık testi için potansiyel kullanıma sahip olabileceğine inanıyoruz. Kesimden hemen sonra akciğerleri elde edin ve evsel bir serin kutuda laboratuvara taşıyın.
Sterilize edilmiş bir yüzeyde ve bir alevin altında çalışın. Akciğerleri otoklavlı alüminyum folyo ile kaplı temiz bir plastik doğrama tahtasına yerleştirin ve bronşiollerin bozulmadan kaldığını kontrol edin. A sitoirde veya taşıma sırasında herhangi bir hasar meydana geldiyse akciğerler kullanıma uygun değildir.
Bir palet bıçağını bir alevin altında ısıtın ve doku yüzeyini sterilize etmek için bıçağı bronşiol çevreleyen akciğer bölgesine çok kısa bir süre dokunun. Steril monte edilmiş bir jilet kullanarak bronşiol çevreleyen yüzey dokusunu kesin, herhangi bir hasarı önlemek için bronşiol paralel kesileri olun. Bronşiol açığa çıktıktan sonra, görünür en yüksek noktadaki bronşiolden kesitsel bir kesi yapın.
Steril forseps kullanarak, bronşiolün serbest ucunun hafifçe tutun ve steril monte edilmiş bir jilet kullanarak kalan istenmeyen dokuları kesin. Bronşiolden bronşiol çıkarmak için herhangi bir dallanma görünmeden önce bronşiol boyunca son bir kesi yapın. Bronşiolleri ilk DMEM RPMI 1640 yıkamaya yerleştirin.
Yıkamada bırakın ve planlanan deney için yeterli doku bölümleri elde etmek için aynı akciğerden ek bronşiol bölümleri hasat edin. Aynı akciğerden ilave bronş bölümlerini yıkamaya yerleştirin ve en az iki dakika yıkamada bırakın. Bronşiolleri ilk yıkamadan çıkarın ve numuneleri steril bir Petri kabına yerleştirin.
Her bronşiolleri steril kümeslerle hafifçe tutun, dokuya zarar vermemeye dikkat edin. Kalan yumuşak dokuyu mümkün olduğunca çıkarın ve steril diseksiyon makası kullanarak dokuyu beş milimetre genişliğinde şeritler halinde kesin. Tüm bronşiyoler doku şeritlerini ikinci DMEM RPMI 1640 yıkamaya yerleştirin.
Onları en az iki dakika yıkamada bırakın, ardından steril forseps kullanarak doku şeritlerini ikinci yıkamadan çıkarın ve temiz, steril bir Petri kabına yerleştirin. Bronşiol bağlı kalan yumuşak dokuları çıkarın ve steril diseksiyon makası kullanarak şeritleri kareler halinde kesin. Petri kabına üçüncü DMEM RPMI 1640 yıkamayı ekleyin ve kabı döndürerek yıkamadaki doku parçalarını hafifçe karıştırın.
Üçüncü yıkamayı doku parçalarını çıkarmadan Petri kabından dökün. Ardından, tüm doku parçalarının kaplanmasını sağlayarak son SCFM yıkamasını ekleyin. SCFM'deki dokuyu UV ışığı altında beş dakika sterilize edin.
Sterilize edilmiş her bronş dokusu parçasını SCFM agarose pedleri içeren 24 kuyulu bir plakanın ayrı kuyularına aktarmak için steril tokmaklar kullanın. Her doku parçasını istenen bakteri suşu ile enfekte etmek için, bir agar plakasında yetişen bir koloniye steril 0,5 mililitre insülin şırıngasına bağlı 29 kalibrelik bir iğnenin ucuyla dokunun, ardından koloniye doku parçasına dokunun, yüzeyi hafifçe batırın. Enfekte olmayan kontroller için, doku parçasının yüzeyini iğnenin ucuyla hafifçe batırın, ardından her kuyuya 500 mikrolitre SCFM eklemek için bir pipet kullanın.
Ultraviyole ışık altındaki her 24 kuyu plakası için 10 dakika boyunca nefes alabilir bir sızdırmazlık zarı sterilize edin. Kapağı 24 kuyu plakasından çıkarın ve solunabilir zarla değiştirin, ardından plakaları titremeden 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Negatif kontrol için bir set ve test edilecek her antibiyotik konsantrasyonu için bir set kullanarak en az iki bağımsız akciğerden akciğer parçaları kümelerini ayarlayın.
48 saatlik inkübasyondan sonra, enfekte olmayan doku parçalarını endojen bakterilerin büyümesi için görsel olarak inceleyin, bu da bu bölümlerin etrafındaki ortamın bulanık olmasına neden olur. Seçilen çalışma türlerinin tipik büyümesi gözlenirse, taze akciğerlerle deneyi yeniden başlatın. Enfekte olmayan doku bölümleri hiç veya minimum bakteri üreme göstermiyorsa, bir adet 24 kuyu yıkama plakası ve bir adet 24 kuyulu tedavi plakası hazırlayın.
Tedavi plakasının her kuyusu, antibiyotiksiz veya ilgi çekici antibiyotik ile 500 mikrolitre taze SCFM içermelidir. Enfekte olmuş her doku parçasını alev sterilize edilmiş asalarla kuluçka plakasından çıkarın. Biyofilmle ilişkili olmayan bakteri hücrelerini çıkarmak ve tedavi plakasının uygun kuyusuna aktarmak için yıkama plakasının taze bir kuyusunda kısa bir süre döndürün.
Tedavi plakasını taze nefes alabilir bir zarla kapatın, ardından 18 ila 24 saat boyunca titremeden 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Her akciğer parçasını 24 kuyu plakasından çıkarmak için alev sterilize edilmiş önseziler kullanın ve bir mililitre PBS ve bir gram metal boncuk içeren steril iki mililitrelik homojenizasyon tüpüne koyun. Boncuk saniyede dört metrede 40 saniye boyunca yendi.
PBS kullanarak akciğer homojenazatını seri olarak seyreltin ve bireysel, tedavi edilmemiş ve antibiyotikle tedavi edilmiş doku parçalarında koloni oluşturan birimleri belirlemek için LB agar üzerine plakalayın. Ex-vivo domuz akciğerinde veya EVPL'de yetiştirildiğinde, P.aeruginosa ve S.aureus'un biyofilmleri, standart ortam kullanarak standart, endüstri onaylı et suyu MIC ve disk testlerindeki duyarlılığa kıyasla antibiyotiklere karşı toleransın arttığını göstermektedir. Farklı antibiyotiklerin EVPL tarafından kurulan bir biyofilm üzerindeki çeşitli etkileri ayırt edilebilir.
Örneğin, P.aeruginosa öldürme EVPL'de 4 ila 16X MIC siprofloksasin ile elde edilir, ancak 4 ila 8X MIC kloramfenikol ile elde edilemez. Disk testinde linezolid'e duyarlı olan S.aureus popülasyonları, evpl'de hedef serum konsantrasyonlarında ve daha yükseklerde hayatta kalabilir. Optimize edilmiş bir in-vitro test bile P.aeruginosa'nın EVPL'deki colistin duyarlılığını doğru bir şekilde tahmin edemez.
EVPL tarafından yetiştirilen bakterilerin üç kütük 10 öldürmesini elde etmek için gereken antibiyotik miktarı genellikle standart in-vitro testlerden hesaplanan MIC veya MBEC'den önemli ölçüde daha yüksektir. Anti-mikrobiyal ajanlar arasındaki farklılıkları ayırt etmenin yanı sıra, bu model farklı bakteri üreme aşamalarında ve farklı antibiyotik dosing aralıklarında duyarlılıktaki değişiklikleri vurgulayabilir. P.aeruginosa biyofilmlerinin olgunlaştıkça meropenem'e artan toleransı burada gösterilmiştir.
S.aureus sağkalımı fluklaksiline maruz kaldıktan sonra 4 ve 24 saat olarak ölçüldü, bu da bakteri hücre sayılarının zaman içinde ve izolatlar arasında azaltılmasındaki farklılıkları gözlemlemeyi mümkün kıldığını belirtti. Bakteriyel yükteki değişimler genellikle uzun kültür süreleri ile artar. Bu, 48 saatlik biyofilm gelişimini ve antibiyotik dosing aralığını hesaba katmak için 24 saat daha maruz kaldıktan sonra tedavi edilmeyen kontrolde görülebilir.
Diseksiyon boyunca mükemmel steril tekniği korumak çok önemlidir, bu nedenle diseksiyonu bir laboratuvarda veya laboratuvarınızın mikrobiyoloji çalışmaları için hiç kullanmadığınız bir alanında yapmanızı öneririz. Son zamanlarda colistin'in biyofilme girişini araştırmak için modeli kullandık ve model biyofilmlere ilaç teslimatını iyileştirmek için araştırmalarda iyi bir kullanım potansiyeline sahip.
