Este método permite que você cresça bactérias em um ambiente que desencadeia fisiologia celular semelhante e morfologia biofilm à que você vê em infecções pulmonares de fibrose cística. Os pulmões são um desperdício na indústria da carne, por isso não há preocupações éticas. O modelo oferece uma plataforma para imitar infecção humana sem a necessidade de um modelo animal vivo.
Essa técnica dá aos pesquisadores uma nova maneira de selecionar drogas candidatas para o potencial de entrar e destruir os biofilmes que se formam em pulmões de fibrose cística. Com mais desenvolvimento e validação, acreditamos que o modelo EVPR poderia ter potencial uso para testes especializados e individualizados de suscetibilidade a antibióticos. Obtenha pulmões imediatamente após o abate e transporte-os para o laboratório em uma caixa de resfriamento doméstica.
Trabalhe em uma superfície esterilizada e sob uma chama. Coloque os pulmões em uma tábua de corte de plástico limpa coberta com papel alumínio autoclavado, e verifique se os brônquios permanecem intactos. Os pulmões não são adequados para uso se houve algum dano no matadouro ou durante o transporte.
Aqueça uma faca de palete sob uma chama e toque brevemente a faca na área do pulmão ao redor do brônquio para esterilizar a superfície do tecido. Corte o tecido superficial ao redor do brônquio usando uma lâmina de barbear montada estéril, fazendo incisões paralelas ao brônquio para evitar qualquer dano. Uma vez exposto o brônquio, faça uma incisão transversal através do brônquio no ponto mais alto visível.
Usando fórceps estéreis, segure levemente a extremidade livre do brônquio e corte qualquer tecido indesejado restante usando uma lâmina de barbear montada estéril. Faça uma incisão transversal final através do brônquio antes que qualquer ramificação seja visível para remover o brônquio dos pulmões. Coloque o brônquio na primeira lavagem DMEM RPMI 1640.
Deixe-o na lavagem e colher seções adicionais de bronquio do mesmo pulmão para produzir seções de tecido suficientes para o experimento planejado. Coloque quaisquer seções adicionais de bronquiolar do mesmo pulmão na lavagem e deixe-as na lavagem por pelo menos dois minutos. Retire os bronquiolos da primeira lavagem e coloque as amostras em uma placa de Petri estéril.
Segure levemente cada brônquio com fórceps estéreis, tomando cuidado para não danificar o tecido. Remova o máximo de tecido mole restante possível, e corte o tecido em tiras de cinco milímetros de largura usando uma tesoura de dissecção estéril. Coloque todas as tiras de tecido bronquiolar na segunda lavagem DMEM RPMI 1640.
Deixe-os na lavagem por pelo menos dois minutos, depois retire as tiras de tecido da segunda lavagem usando fórceps estéreis e coloque-as em uma placa de Petri limpa e estéril. Remova qualquer tecido mole restante preso ao brônquio e corte as tiras em quadrados usando uma tesoura de dissecção estéril. Adicione o terceiro DMEM RPMI 1640 na placa de Petri e misture levemente os pedaços de tecido na lavagem girando o prato.
Despeje a terceira lavagem da placa de Petri sem remover os pedaços de tecido. Em seguida, adicione a lavagem SCFM final, garantindo que todas as peças de tecido estejam cobertas. Esterilize o tecido em SCFM sob luz UV por cinco minutos.
Use fórceps estéreis para transferir cada peça de tecido bronquiolar esterilizado em poços individuais de uma placa de 24 poços contendo almofadas de agarose SCFM. Para infectar cada peça de tecido com a cepa bacteriana desejada, toque uma colônia cultivada em uma placa de ágar com a ponta de uma agulha de calibre 29 presa a uma seringa de insulina estéril de 0,5 mililitro, em seguida, toque a colônia na peça de tecido, gentilmente picando a superfície. Para os controles não infectados, pique suavemente a superfície da peça de tecido com a ponta da agulha, em seguida, use uma pipeta para adicionar 500 microliters de SCFM a cada poço.
Esterilize uma membrana de vedação respirável para cada placa de 24 poços sob luz ultravioleta por 10 minutos. Retire a tampa da placa de 24 poços e substitua-a pela membrana respirável, em seguida, incubar as placas a 37 graus Celsius sem tremer. Configure conjuntos de peças pulmonares de pelo menos dois pulmões independentes, usando um conjunto para um controle negativo, e um conjunto por cada concentração de antibiótico a ser testado.
Após 48 horas de incubação, inspecione visualmente os pedaços de tecido não infectados para o crescimento de bactérias endógenas, o que faria com que o meio ao redor dessas seções fosse turva. Se o crescimento típico das espécies de estudo selecionadas for observado, reinicie o experimento com pulmões frescos. Se as seções de tecido não infectadas apresentarem nenhum ou crescimento bacteriano mínimo, prepare uma placa de lavagem de 24 poços e uma placa de tratamento de 24 poços.
Cada poço da placa de tratamento deve conter 500 microliters de SCFM fresco sem antibióticos, ou com o antibiótico de interesse. Remova cada peça de tecido infectado da placa de incubação com fórceps esterilizados por chamas. Gire-o brevemente em um poço fresco da placa de lavagem para remover quaisquer células bacterianas não associadas ao biofilme e transferi-la para o poço apropriado da placa de tratamento.
Sele a placa de tratamento com uma membrana respirável fresca e, em seguida, incuba-a a 37 graus Celsius sem tremer por 18 a 24 horas. Use fórceps esterilizados por chama para remover cada peça pulmonar da placa de 24 poços, e coloque-a em um tubo de homogeneização de dois mililitros estéril contendo um mililitro de PBS e um grama de contas metálicas. Bead bateu por 40 segundos a quatro metros por segundo.
Diluir o pulmão em série, homogeneizar usando PBS, e emplacar-o em ágar LB para determinar as unidades formadoras da colônia em peças de tecido individual, não tratada e tratada com antibióticos. Quando cultivados no pulmão de porco ex-vivo ou EVPL, biofilmes de P.aeruginosa e S.aureus demonstram maior tolerância a antibióticos em comparação com a suscetibilidade em ensaios padrão, aprovados pela indústria, MIC e ensaios de disco usando mídia padrão. Os vários efeitos de diferentes antibióticos em um biofilme estabelecido pela EVPL são distinguíveis.
Por exemplo, a morte de P.aeruginosa é alcançada em EVPL com ciprofloxacina MIC de 4 a 16X, mas não com clororamfenicol MIC de 4 a 8X. Populações s.aureus suscetíveis a linezolid no ensaio de disco são capazes de sobreviver a concentrações de soro-alvo e maiores em EVPL. Mesmo um ensaio in vitro otimizado não pode prever com precisão a suscetibilidade de P.aeruginosa à colistina no EVPL.
A quantidade de antibiótico necessária para alcançar três mortes de 10 troncos de bactérias cultivadas por EVPL é muitas vezes significativamente maior do que o MIC ou o MBEC calculado a partir de ensaios in vitro padrão. Além de distinguir diferenças entre agentes antimicrobianos, este modelo pode destacar mudanças na suscetibilidade em diferentes estágios de crescimento bacteriano e para diferentes intervalos de dosagem de antibióticos. A crescente tolerância dos biofilmes de P.aeruginosa ao meropenem à medida que amadurecem é mostrada aqui.
A sobrevida de S.aureus foi medida em 4 e 24 horas após a exposição à flucloxacilina, possibilitando observar diferenças na redução da contagem de células bacterianas ao longo do tempo e entre isolados. Variações na carga bacteriana muitas vezes aumentam com tempos de cultura prolongados. Isso pode ser visto no controle não tratado após o desenvolvimento de biofilme de 48 horas e uma exposição adicional de 24 horas para explicar o intervalo de dosagem de antibióticos.
É crucial manter uma excelente técnica estéril durante toda a dissecção, por isso recomendamos fazer a dissecção em um laboratório ou em uma área do seu laboratório que você nunca usa para trabalhos de microbiologia. Recentemente usamos o modelo para explorar a entrada de colistina no biofilme, e o modelo tem um bom potencial de uso em pesquisas para melhorar a entrega de medicamentos em biofilmes.
