Diese Methode ermöglicht es Ihnen, Bakterien in einer Umgebung zu züchten, die eine ähnliche Zellphysiologie und Biofilmmorphologie auslöst wie bei Mukoviszidose-Lungeninfektionen. Die Lunge ist ein Abfallprodukt in der Fleischindustrie, daher gibt es keine ethischen Bedenken. Das Modell bietet eine Plattform, um menschliche Infektionen nachzuahmen, ohne dass ein Lebendtiermodell erforderlich ist.
Diese Technik bietet Forschern eine neue Möglichkeit, Kandidatenmedikamente auf das Potenzial zu überprüfen, in die Biofilme einzudringen und diese zu zerstören, die sich in Mukoviszidose-Lungen bilden. Mit der Weiterentwicklung und Validierung glauben wir, dass das EVPR-Modell potenziellen Nutzen für spezialisierte und individualisierte Antibiotika-Empfindlichkeitstests haben könnte. Erhalten Sie die Lunge unmittelbar nach der Schlachtung und transportieren Sie sie in einer haushaltstölen Kühlbox ins Labor.
Arbeiten Sie auf einer sterilisierten Oberfläche und unter einer Flamme. Legen Sie die Lunge auf ein sauberes Kunststoff-Schneidebrett, das mit autoklavierter Aluminiumfolie bedeckt ist, und überprüfen Sie, ob die Bronchiolen intakt bleiben. Die Lunge ist nicht für den Einsatz geeignet, wenn es im Schlachthof oder während des Transports zu Schäden gekommen ist.
Erhitzen Sie ein Palettenmesser unter einer Flamme und berühren Sie das Messer sehr kurz mit dem Bereich der Lunge, der die Bronchiole umgibt, um die Oberfläche des Gewebes zu sterilisieren. Schneiden Sie das Oberflächengewebe, das die Bronchiole umgibt, mit einer steril montierten Rasierklinge ab und machen Sie Schnitte parallel zur Bronchiole, um Schäden zu vermeiden. Sobald die Bronchiole freigelegt wurde, machen Sie einen Querschnittsschnitt durch die Bronchiole am höchsten Punkt sichtbar.
Halten Sie mit einer sterilen Zette das freie Ende der Bronchiole leicht und schneiden Sie das verbleibende unerwünschte Gewebe mit einer steril montierten Rasierklinge ab. Machen Sie einen letzten Querschnittsschnitt über die Bronchiole, bevor eine Verzweigung sichtbar ist, um die Bronchiole aus der Lunge zu entfernen. Legen Sie die Bronchiole in die erste DMEM RPMI 1640 Wäsche.
Lassen Sie es in der Wäsche und ernten Sie zusätzliche Bronchiolabschnitte aus derselben Lunge, um genügend Gewebeabschnitte für das geplante Experiment zu erhalten. Legen Sie alle zusätzlichen Bronchiolenabschnitte aus derselben Lunge in die Wäsche und lassen Sie sie mindestens zwei Minuten in der Wäsche. Entfernen Sie die Bronchiolen aus der ersten Wäsche und legen Sie die Proben in eine sterile Petrischale.
Halten Sie jede Bronchiole leicht mit einer sterilen Zette und achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu beschädigen. Entfernen Sie so viel verbleibendes Weichgewebe wie möglich und schneiden Sie das Gewebe mit einer sterilen Dissektionsschere in fünf Millimeter breite Streifen. Legen Sie alle bronchiolischen Gewebestreifen in die zweite DMEM RPMI 1640-Wäsche.
Lassen Sie sie mindestens zwei Minuten in der Wäsche, entfernen Sie dann die Gewebestreifen aus der zweiten Wäsche mit einer sterilen Zette und legen Sie sie in eine saubere, sterile Petrischale. Entfernen Sie das verbleibende Weichgewebe, das an der Bronchiole befestigt ist, und schneiden Sie die Streifen mit einer sterilen Dissektionsschere in Quadrate. Die dritte DMEM RPMI 1640 Wäsche in die Petrischale geben und die Gewebestücke in der Wäsche leicht mischen, indem Sie die Schüssel schwenken.
Gießen Sie die dritte Wäsche aus der Petrischale, ohne die Gewebestücke zu entfernen. Fügen Sie dann die endgültige SCFM-Wäsche hinzu und stellen Sie sicher, dass alle Gewebestücke bedeckt sind. Sterilisieren Sie das Gewebe in SCFM unter UV-Licht für fünf Minuten.
Verwenden Sie eine sterile Zette, um jedes sterilisierte bronchiolische Gewebestück in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit SCFM-Agarose-Pads zu übertragen. Um jedes Gewebestück mit dem gewünschten Bakterienstamm zu infizieren, berühren Sie eine kolonie, die auf einer Agarplatte mit der Spitze einer 29-Gauge-Nadel an einer sterilen 0,5-Milliliter-Insulinspritze befestigt ist, berühren Sie dann die Kolonie auf das Gewebestück und stechen Sie sanft auf die Oberfläche. Für die nicht infizierten Kontrollen stechen Sie vorsichtig mit der Nadelspitze auf die Oberfläche des Gewebestücks und fügen Sie dann mit einer Pipette 500 Mikroliter SCFM zu jeder Vertiefung hinzu.
Sterilisieren Sie eine atmungsaktive Dichtungsmembran für jede 24-Well-Platte unter ultraviolettem Licht für 10 Minuten. Entfernen Sie den Deckel von der 24-Well-Platte und ersetzen Sie ihn durch die atmungsaktive Membran, dann inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius ohne zu schütteln. Richten Sie replizierte Sätze von Lungenstücken aus mindestens zwei unabhängigen Lungen ein, wobei Sie einen Satz für eine Negativkontrolle und einen Satz pro getesteter Antibiotikakonzentration verwenden.
Untersuchen Sie nach 48 Stunden Inkubation die nicht infizierten Gewebestücke visuell auf das Wachstum endogener Bakterien, wodurch das Medium um diese Abschnitte herum trüb wird. Wenn ein für die ausgewählte Studienart typisches Wachstum beobachtet wird, starten Sie das Experiment mit frischen Lungen. Wenn die nicht infizierten Gewebeabschnitte kein oder nur minimales Bakterienwachstum aufweisen, bereiten Sie eine 24-Well-Waschplatte und eine 24-Well-Behandlungsplatte vor.
Jede Vertiefung der Behandlungsplatte sollte 500 Mikroliter frisches SCFM ohne Antibiotika oder mit dem interessierenden Antibiotikum enthalten. Entfernen Sie jedes infizierte Gewebestück mit einer flammensterilisierten Zwiege von der Inkubationsplatte. Schwenken Sie es kurz in einen frischen Brunnen der Waschplatte, um alle nicht biofilm-assoziierten Bakterienzellen zu entfernen und in den entsprechenden Brunnen der Behandlungsplatte zu übertragen.
Verschließen Sie die Behandlungsplatte mit einer frischen atmungsaktiven Membran und inkubieren Sie sie dann bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln für 18 bis 24 Stunden. Verwenden Sie eine flammensterilisierte Zette, um jedes Lungenstück von der 24-Well-Platte zu entfernen, und legen Sie es in ein steriles Zwei-Milliliter-Homogenisierungsröhrchen mit einem Milliliter PBS und einem Gramm Metallperlen. Bead schlug 40 Sekunden lang mit vier Metern pro Sekunde.
Verdünnen Sie das Lungenhomogenat mit PBS seriell und platten Sie es auf LB-Agar, um die koloniebildenden Einheiten in einzelnen, unbehandelten und antibiotikabehandelten Gewebestücken zu bestimmen. Wenn sie in der Ex-vivo-Schweinelunge oder EVPL gezüchtet werden, zeigen Biofilme von P.aeruginosa und S.aureus eine erhöhte Toleranz gegenüber Antibiotika im Vergleich zur Anfälligkeit in standardmäßigen, industriezugelassenen Brühe-MIC- und Disk-Assays mit Standardmedien. Die verschiedenen Wirkungen verschiedener Antibiotika auf einen EVPL-etablierten Biofilm sind unterscheidbar.
Zum Beispiel wird die P.aeruginosa-Abtötung in EVPL mit 4 bis 16X MIC Ciprofloxacin erreicht, jedoch nicht mit 4 bis 8X MIC Chloramphenicol. S.aureus-Populationen, die im Disk-Assay anfällig für Linezolid sind, können Target-Serum-Konzentrationen und höhere in EVPL überleben. Selbst ein optimierter In-vitro-Assay kann die Anfälligkeit von P.aeruginosa für Colistin im EVPL nicht genau vorhersagen.
Die Menge an Antibiotika, die erforderlich ist, um drei log 10-Abtötungen von EVPL-gezüchteten Bakterien zu erreichen, ist oft signifikant höher als die MIC oder die MBEC, die aus Standard-In-vitro-Assays berechnet wird. Neben der Unterscheidung von Unterschieden zwischen antimikrobiellen Wirkstoffen kann dieses Modell Veränderungen der Anfälligkeit in verschiedenen Bakterienwachstumsstadien und für verschiedene Antibiotika-Dosierungsintervalle aufzeigen. Die zunehmende Toleranz von P.aeruginosa-Biofilmen gegenüber Meropenem bei ihrer Reife wird hier gezeigt.
Das Überleben von S.aureus wurde 4 und 24 Stunden nach der Exposition gegenüber Flucloxacillin gemessen, so dass Unterschiede in der Verringerung der Bakterienzellzahl im Laufe der Zeit und zwischen den Isolaten beobachtet werden konnten. Variationen in der Bakterienlast nehmen oft mit längeren Kulturzeiten zu. Dies zeigt sich in der unbehandelten Kontrolle nach 48-stündiger Biofilmentwicklung und einer weiteren 24-Stunden-Exposition, um das Antibiotika-Dosierungsintervall zu berücksichtigen.
Es ist wichtig, während der gesamten Dissektion eine ausgezeichnete sterile Technik beizubehalten, daher empfehlen wir, die Dissektion in einem Labor oder in einem Bereich Ihres Labors zu durchführen, den Sie niemals für mikrobiologische Arbeiten verwenden. Wir haben das Modell kürzlich verwendet, um den Eintritt von Colistin in Den Biofilm zu untersuchen, und das Modell hat ein gutes Potenzial für den Einsatz in der Forschung, um die Wirkstoffabgabe in Biofilme zu verbessern.
