La méthode des tranches pulmonaires coupées avec précision préservera la structure et les orientations spatiales en trois dimensions sans biais régional et peut servir de modèle de substitution vivant pour les mesures de la contractilité des vaisseaux et des voies respiratoires. En combinaison avec l’imagerie time-lapse, le transfert western et l’analyse de l’ARN, les tranches pulmonaires coupées avec précision contribuent à la compréhension globale des cascades de signalisation qui sous-tendent une grande variété de troubles et conduisent à une meilleure compréhension de la physiopathologie des maladies vasculaires pulmonaires. Pour commencer, placez la souris adulte euthanasiée en position couchée et fixez-la en place en scotchant les pattes et le nez à la table avec du ruban adhésif.
Vaporiser la surface ventrale de la souris avec 70% d’éthanol. Utilisez des pinces pour soulever la peau abdominale de la souris à l’emplacement de la vessie et des ciseaux chirurgicaux pour couper à la ligne médiane, en se déplaçant de manière supérieure vers la région cervicale pour exposer la trachée. Ensuite, utilisez une pince à épiler pour soulever la couche de fascia sous-jacente et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour exposer les organes viscéraux et le compartiment médiastinal, coupant à nouveau de manière inférieure à supérieure.
Coupez le sternum à la ligne médiane pour exposer le cœur et les poumons. Disséquez soigneusement le diaphragme du foie et du compartiment abdominal. Localisez la veine cave inférieure sous les intestins et coupez-la.
Après avoir localisé le ventricule droit, utilisez une aiguille papillon de calibre 25 à 30 pour injecter 0,5 millilitre d’héparine fractionnée à 1% dans le ventricule droit et rincez-le lentement mais régulièrement avec 10 à 15 millimètres de PBS. Après avoir localisé le larynx, utilisez une pince à épile émoussée pour disséquer le fascia et les tissus environnants, puis placez la suture chirurgicale sous la trachée et nouez lâchement un nœud chirurgical. Placez un petit trou dans la trachée supérieur à la ficelle et canulez avec une aiguille émoussée de calibre 20.
Serrez la suture autour de l’aiguille et de la trachée à l’aide d’un nœud chirurgical. Injectez ensuite 2,5 à 4 millilitres d’agarose dans la trachée et surveillez l’inflation du poumon. Après l’injection d’agarose, versez du PBS froid sur le poumon pour solidifier l’agarose.
Ensuite, coupez la trachée supérieure à la suture chirurgicale et disséquez le poumon et le cœur du médiastin en enlevant les adhérences et le fascia. Après la solidification, placez le tissu dans le DMEM dans une boîte de Petri sur de la glace et procédez immédiatement au tranchage d’un lobe à l’aide d’une machine à vibratome. Pour préparer les tranches de poumon, fixez l’échantillon à la plate-forme avec de la supercolle, en gardant le côté médial tourné vers le haut.
Remplissez ensuite le récipient d’échantillon avec PBS. Remplissez le récipient avec de la glace pour garder le PBS environnant et échantillonnez au froid. Allumez le vibratome.
Ajustez l’épaisseur à 300 micromètres, la fréquence à 100 Hertz, l’amplitude à 0,6 millimètre et la vitesse à cinq micromètres par seconde. À l’aide d’une clé Allen, tournez le porte-lame en position de sécurité et ouvrez les mâchoires pour insérer une lame. Ensuite, serrez les mâchoires avec une clé Allen.
Placez l’échantillon sur la boîte, en vous assurant qu’il est immergé dans PBS. Faites glisser la boîte dans la bonne position et assurez-vous qu’elle est sécurisée. Tournez le support de lame dans la position appropriée pour le tranchage.
Amenez la lame du vibratome jusqu’au bord du bloc et abaissez manuellement la lame jusqu’à ce qu’elle soit uniforme avec le haut de l’échantillon. Confirmez les paramètres et exécutez le vibratome. Une fois les tranches fraîches coupées, retirez les échantillons du PBS et placez-les dans une boîte de Petri stérile avec 10 millilitres de DMEM contenant un antibiotique antimycotique unique.
Après avoir placé toutes les tranches dans une boîte de Pétri, rétractez entièrement la lame et utilisez la clé Allen pour soulever la lame dans une position sûre. Conservez les échantillons dans du DMEM à 37 degrés Celsius. Et placez une tranche de vibratome sur une lame de microscope.
Utilisez une lingette nettoyante pour éliminer l’excès de liquide. Placez l’échantillon sur la microscopie à contraste de phase et utilisez un grossissement de 10 à 20X pour identifier un récipient. Ajoutez ensuite 500 microlitres de vasoconstricteurs, tels que du chlorure de potassium de 60 millimolaires ou un endothéline-1 micromolaire pour immerger complètement la lame.
Observez et capturez la vidéo en enregistrant pendant 30 à 60 secondes. Avant de commencer l’expérience, remplissez une petite boîte en mousse de polystyrène avec un litre d’azote liquide et placez deux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre dans le récipient avec de l’azote liquide. Placez quatre à cinq tranches de vibratome frais dans un bol de mortier.
Versez 5 à 10 millilitres d’azote liquide sur les tranches et utilisez rapidement le pilon pour broyer les tranches en poudre avant que l’azote liquide ne s’évapore. Utilisez une pelle de laboratoire en acier pré-réfrigéré pour pré-réfrigérer la poudre dans les deux tubes de microcentrifugation réfrigérés et lyser la poudre en ajoutant 500 microlitres de réactif d’extraction d’ARN pour l’isolement de l’ARN ou 500 microlitres de tampon RIPA pour la lyse des protéines. Dans l’expérience de viabilité représentative, le changement de couleur des tranches PCLS a été détecté du jour zéro au premier jour et du neuvième au 10e jour.
La solution était initialement bleue et est devenue rose du jour au lendemain, démontrant ainsi sa viabilité. Le changement de couleur s’est généralement produit dans les une à quatre heures, mais un temps plus long peut être nécessaire. La différence quotidienne entre l’absorbance à des longueurs d’onde de 562 et 613 nanomètres pour le tissu préparé par vibratome est montrée ici.
La constriction du système vasculaire dans un tissu pulmonaire préparé par vibratome à l’aide d’endothéline-1 et de chlorure de potassium peut être visualisée ici. La préservation du label tdTomato dans les cellules une semaine après l’injection de tamoxifène est démontrée dans ces tranches pulmonaires. Il est très important de bien effectuer l’étape de clairage et de gonflage des poumons pour retirer tout le sang de la circulation avant des expériences et des images supplémentaires.
En plus des maladies vasculaires, le PCLS peut être appliqué pour étudier la physiobiologie des maladies liées aux voies respiratoires et peut être testé davantage sur les tissus pulmonaires humains dans des scénarios cliniquement pertinents.
