La spectroscopie de résonance plasmonique de surface a été établie pour la détermination du ligand protéique de manière à débit moyen. Différentes affinités pour les variantes de site de liaison de la même molécule sont présentées, notamment pour les oligosaccharides de haute liaison au fer sur les virus. SPR est une technique sans marquage pour étudier la liaison macromoléculaire en temps réel des récepteurs immobilisés en surface.
Les interactions multicentriques sont reconnues dans l’analyse cinétique par liaison compétitive indépendamment de la taille de la Les domaines spécifiques de la recherche qui utilisent la SPR sont le développement de médicaments pour rechercher des inhibiteurs ou la caractérisation des anticorps. Les constantes cinétiques et les affinités sont directement calculées à partir de la réponse du capteur. Pour commencer, transférez 100 microlitres de la solution sur des plaques de LB-agar et étalez-la doucement à l’aide d’un épandeur de cellules stériles.
Commencez une série de réactions d’échantillons en utilisant plusieurs concentrations de matrice d’ADN double brin allant de cinq à 50 nanogrammes tout en maintenant la concentration de l’amorce constante. Ensuite, ajoutez l’enzyme de restriction DpnI sous la couche d’huile minérale et incuber immédiatement à 37 degrés Celsius pendant une heure pour digérer l’ADN double brin superenroulé parental. Pour décongeler les cellules supercompétentes XL1-Blue, aliquote les cellules dans un petit tube de fond rond pré-refroidi.
Ensuite, transférez un microlitre de l’ADN simple brin traité par DpnI de chaque réaction de contrôle et d’échantillon à des aliquotes séparées des cellules supercompétentes qui synthétisent le brin complémentaire. Après avoir soigneusement fait tourbillonner les réactions de transformation pour mélanger, incuber les réactions sur de la glace pendant 30 minutes. Appliquez une impulsion de chaleur aux réactions de transformation à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes, puis placez les réactions sur de la glace pendant deux minutes.
Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de NZY + bouillon et incuber les réactions de transformation à 37 degrés Celsius avec agitation à 225 à 250 tr / min pendant une heure. Ensuite, plaquez le volume correct de chaque réaction de transformation sur des plaques de gélose à l’ampicilline LB comme démontré précédemment. Pour une culture de semences, inoculer une petite quantité de milieu LB contenant de l’ampicilline avec une seule colonie de la plaque transformée.
En utilisant la culture de nuit, inoculer la culture d’expression avec des additifs, y compris 10 millimolaires de chlorure de magnésium, 10 millimolaires de sulfate de magnésium et 20 millimolaires de glucose, en diluant la culture de graines à une par 100. Ensuite, cultivez des cellules avec une agitation vigoureuse à 37 degrés Celsius à un absorbant de 600 nanomètres entre 0,4 et 0,6 avant de refroidir les cellules à 20 degrés Celsius et d’induire avec une IPTG millimolaire et de croître pendant la nuit. Ensuite, récoltez les cellules par centrifugation à 4 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant.
Après remise en suspension de la pastille cellulaire dans un tampon salin tamponné au phosphate, refuge récent à 4 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez ensuite le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, remettez en suspension la pastille restante dans 10 millilitres de tampon de lyse et incuber la suspension pendant une heure à 37 degrés Celsius.
Ensuite, séparez les fractions solubles et insolubles par centrifugation à 4 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. De plus, utilisez le gel d’affinité Ni2+Affinity HIS-Select dans des tubes de 14 millilitres pour lier et remettre en suspension sa cyanovirine-N exprimée par recombinaison marquée dans des solutions tampons contenant 20 millimolaires d’imidazole et 250 millimolaires d’imidazole, respectivement. Incuber par lots pendant au moins 30 minutes entre ces étapes.
Ajout du tampon d’élution contenant 250 millimolaires imidazole à la protéine éluée. Transférer les solutions protéiques dans des tubes de centrifugation à l’aide d’un filtre de coupure Dalton de 10 kilos et les concentrer par centrifugation pendant 10 minutes à 4 500 g et quatre degrés Celsius. Ajouter le tampon courant SPR à un facteur de dilution de un à 10 et centrifuger quatre fois au volume initial pendant 10 minutes à 4 500 g et quatre degrés Celsius.
Ensuite, déterminez la concentration de protéines à 280 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible NanoDrop basé sur le coefficient d’extinction calculé pour la protéine principale CVN2L0 montrant une taille de 23, 474 Dalton. Pour le système SPR à double canal, utilisez HBSCP plus comme tampon de fonctionnement, de l’acide chlorhydrique glycine 10 millimolaires de pH 1,5 à 1,6 comme tampon de régénération et allumez le dégazeur de l’instrument, l’échantillonneur automatique et la pompe. Ensuite, lavez l’ensemble du système avec de l’eau distillée double pendant une heure.
Ensuite, déposez de l’huile d’immersion sur le détecteur et montez une puce de capteur en verre recouverte d’un mince film d’or. Et sur la face supérieure, fonctionnalisé avec de l’hydrogel de carboxyméthyl dextran directement sur le détecteur sous la cellule d’écoulement à trois ports. Ensuite, corrigez le réglage en tirant vers le bas la manipulation.
Pour immobiliser les ligands protéiques sur les puces du capteur, ouvrez une table d’exécution en cliquant sur Formulaire dans la barre de menus et exécutez l’éditeur de tableau dans le logiciel de liaison automatique SPP intégré. Ensuite, choisissez et cliquez sur Immobilisation de base dans la liste des tables d’exécution disponibles et suivez les étapes de la procédure expérimentale sur l’écran de l’ordinateur. Ensuite, cliquez sur Sample Set Editor dans la section formulaire pour remplir la liste des réactifs pour deux racks placés dans l’échantillonneur automatique pour une analyse plus approfondie.
Cliquez sur Autosampler Direct Control comme outil dans la barre de menus pour avancer ou ramener les racks à la maison et choisissez quatre degrés Celsius comme température de fonctionnement. Démarrez la pompe pour infuser de l’eau distillée double en cliquant sur Outils et commande directe de la pompe. Et enregistrez les données en cliquant sur SPR Instrument Direct Control.
Et à chaque fois, commencez dans la fenêtre qui apparaît. Après avoir ajouté les réactifs de couplage dans des flacons de 300 microlitres, placez-les dans les racks d’échantillonneur automatique et démarrez la table d’exécution en cliquant sur Exécuter. Pour l’interaction protéine-protéine simple, après avoir rempli la pompe à 25 000 microlitres par minute, effectuez un ajustement de base pendant 30 secondes.
Laisser procéder à l’ajustement de base suivant avec de l’eau distillée double pendant 1,5 minute avant d’éteindre la surface de la puce activée avec un chlorhydrate d’éthanolamine molaire, pH 8,5. Ensuite, passez les tubes de l’échantillonneur liquide au dégazeur de l’eau distillée double dans la bouteille avec HBS-EP + Cliquez sur Formulaire, faites défiler vers le bas et passez au post-traitement en cliquant sur ce mode de fonctionnement. Cliquez ensuite sur Ajouter pour sélectionner les courbes de liaison générées au fil du temps dans la plate-forme de données pour chaque cellule de flux et exporter la superposition sous forme de fichier d’épuration.
Ensuite, cliquez sur Fichier pour ouvrir les options de sauvegarde du fichier et obtenir des courbes de réponse en alignant les courbes gauche et droite et en soustrayant les signaux du deuxième canal de référence de ceux du canal du ligand. Des injections uniques de CVN2L0 et de variance V2 et V5 ont d’abord été testées pour se lier à la puce du capteur couplé à l’hémagglutinine afin d’estimer les capacités de liaison à l’aide de l’échantillonneur automatique et de l’éditeur de table en cours d’exécution. Des injections répétées ont été automatisées à diverses concentrations dans la gamme nanomolaire et micromolaire du système au fil du temps, démontrant qu’aucune saturation à la surface de la puce ni liaison à l’équilibre n’a été atteinte.
La concentration par rapport à la réponse a été tracée pour la liaison de type sauvage CVN au RBD, en supposant un ciblage spécifique des glucides éventuellement conservés sur la sous-unité RBD S1 avec une affinité plus faible ayant une constante de taux de dissociation de 260 micromoles. Le même tracé d’affinité pour la liaison CVN2L0-V4 au DM n’est plus analysable en raison du remplacement des liaisons disulfures qui interfèrent avec la liaison de haute affinité aux petits peptides glycosylés et donne une réponse plus élevée que la valeur maximale de réponse. La liaison de type sauvage CVN au RBD sur le SARS-CoV-2 montre une liaison à la protéine S et au RBD avec une constante de rage de dissociation de 18,6 micromoles et 260 micromoles, respectivement.
Bien que la réponse SPR pour les concentrations d’analytes entraîne des unités de réponse élevées et des capteurs SPR typiques pour le type sauvage CVN et la liaison E41A. Cependant, le mutant est instable lorsqu’il est dilué. La biodétection SPR traite de la liaison à haute affinité et à faible affinité des protéines purifiées et de ses variantes aux ligands.
Dans notre cas, les glycoprotéines exploitent la lecture optique et le système d’écoulement à double canal sur la surface de la puce du capteur. Le dosage immuno-enzymatique est une méthode immunologique alternative reconnaissant les épitopes protéiques, mais fournissant également des données sur la concentration de peptides et de petites molécules à partir de matrices complexes. Les tests de protéines exprimées par recombinaison par des tests de liaison SPR ont incorporé la biodétection des changements de confirmation, ce qui est utile pour la vérification et la prédiction de la stabilité des protéines par le côté protéique computationnel.
