Ce protocole permet d’isoler et de mettre en culture avec succès des fibroblastes associés au cancer primaire du cancer du sein murin, afin de dépister de nouvelles nanoparticules conçues pour cibler le micro-environnement tumoral. Les FAC primaires représentent le modèle physiologique le plus fiable pour les études in vitro du stroma tumoral. Dans ce protocole, nous décrivons comment obtenir un rendement optimal.
Pour commencer, préparez un mélange de digestion pour la dissociation tumorale et faites tremper les fragments de tumeur de trois à cinq millimètres dans la solution après avoir fermé hermétiquement le tube. Tournez le tube à l’envers, en vérifiant que tous les morceaux de tumeur sont au bas du tube vers le capuchon. Ensuite, fixez le tube à un dissociater mécanique dans le boîtier approprié et exécutez un programme de dissociation spécialement conçu pour les tumeurs dures.
Après la course, détachez le tube et placez-le à l’envers pour incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes en le secouant doucement. Ensuite, reconnectez le tube au dissociater dans le boîtier approprié et exécutez le programme de dissociation pour les tumeurs dures deux fois, en vous assurant qu’il ne reste pas de gros morceaux de tissu à la fin de la procédure. Filtrer l’échantillon à travers une passoire cellulaire de 40 microns dans un tube de 50 millilitres.
Lavez ensuite le filtre avec 10 millilitres de milieu RPMI 1640 et centrifugeuse. Après centrifugation, ressuspendez la pastille dans un tampon PBE, composé de PBS, de 0,5% de BSA et de deux millimolaires EDTA, et comptez les cellules avec trypan blue. Réparez le tampon de liaison d’élimination des cellules mortes en diluant la solution tampon de liaison 20X avec de l’eau distillée double stérile.
Lavez les cellules avec cinq millilitres de tampon de liaison 1X et de centrifugeuse. Après centrifugation, resuspendez la pastille cellulaire avec 0,1 millilitre de microbilles d’élimination des cellules mortes jusqu’à 10 à la septième cellule et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Pendant l’incubation, préparez un support magnétique sous le capot et y accrochez des colonnes de séparation ferromagnétique, les pointes pointant vers le bas.
Équilibrez les colonnes avec 0,5 millilitre de tampon de liaison à froid et attendez que la solution ait coulé. Après l’incubation, ajouter 400 microlitres de tampon de liaison à froid à la suspension de la perle et de la cellule. Chargez tout le volume sur la colonne et collectez l’effluent dans un tube de 15 millilitres.
Lavez la colonne quatre fois avec 0,5 millilitre de tampon de liaison à froid et collectez l’effluent total dans le même tube. Pour l’épuisement des fibroblastes non associés au cancer, filtrez la suspension cellulaire à l’aide d’une passoire cellulaire de 70 microns humidifiée avec du PBS et centrifugez les cellules. Retirez le surnageant et ressuspendez la pastille dans 80 microlitres de tampon PBE froid.
Ajouter 20 microlitres de cocktail d’épuisement des fibroblastes non associés à la tumeur. Bien mélanger et incuber l’échantillon à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’obscurité. Pendant l’incubation avec des perles, préparez des colonnes d’épuisement ferromagnétiques sur un support magnétique.
Équilibrez les colonnes avec deux millilitres de tampon PBE froid et attendez que la solution ait coulé. Après l’incubation, ajouter 400 microlitres de tampon à la suspension de la perle et de la cellule. Chargez tout le volume sur la colonne et collectez l’effluent dans un tube de 15 millilitres.
Lavez la colonne deux fois avec deux millilitres de PBE. Recueillir l’effluent total dans le même tube et centrifuger l’effluent. Pour la sélection positive des fibroblastes associés au cancer, resuspendez la pastille dans 80 microlitres de tampon PBE froid.
Ensuite, à 20 microlitres de microbilles de fibroblastes associées à la tumeur, et incubez les échantillons à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’obscurité. Pendant l’incubation, préparez des colonnes de séparation ferromagnétique sur un support magnétique et équilibrez-les avec 0,5 millilitre de tampon PBE froid. Après l’incubation, ajouter 400 microlitres de PBE à la suspension de la perle et de la cellule.
Chargez tout le volume sur la colonne et laissez les cellules non étiquetées s’écouler dans un tube de 15 millilitres. Lavez la colonne trois fois avec 0,5 millilitre de tampon PBE et collectez l’effluent total dans le même tube. Retirez la colonne de l’aimant et placez-la dans un tube de 1,5 millilitre.
Ajoutez un millilitre de PBE sur la colonne et poussez immédiatement le piston dans la colonne pour vider les cellules. Après centrifugation, ressuspendez la pastille cellulaire dans un volume approprié de DMEM et ensemencez les cellules dans une plaque de culture tissulaire. Vérifiez la densité cellulaire au microscope et placez la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour permettre aux cellules d’adhérer et de se développer.
L’injection de cellules luciférases 4T1 dans le coussinet adipeux mammaire de souris femelles a conduit à la croissance d’une masse tumorale détectable cinq jours après l’implantation. Pour trouver une fenêtre de sacrifice adéquate pour l’isolement des FAC, un compromis optimal a été recherché entre une taille tumorale plus élevée et l’imagerie par bioluminescence d’une part, et une ulcération tumorale émergente et une nécrose d’autre part. Le jour 20 a été défini comme point de temps pour optimiser la récupération cellulaire, après le processus d’isolement.
Deux autres passages ont été nécessaires pour isoler la population de CAF, à partir du panel de cellules viables collectées, l’épuisement des fibroblastes non associés à la tumeur et l’enrichissement des fibroblastes associés à la tumeur. Les cellules CAF ont révélé une grande morphologie en forme de fuseau, typique des fibroblastes, et étaient différentes des cellules tumorales 4T1. L’expression du PAF suivie sur cinq passages confirme que la culture primaire des FAC a conservé ses caractéristiques d’origine.
Lorsque la durée et la température des incubations avec des microbilles n’ont pas été maintenues, des clones de morphologie différente ont été trouvés parmi la culture isolée. Ces cellules contaminantes se sont développées plus rapidement et ont prévalu sur la culture primaire de CAF. La liaison des CAF avec le nanomédisant fonctionnalisé Hfn-FAP de ferritine humaine a augmenté de trois fois à une à une et de fragment d’anticorps de un à cinq, par rapport au HFN nu.
Au contraire, pour les cellules tumorales 4T1, le HFN nu a montré une liaison plus élevée que le HFN fonctionnalisé. Pour augmenter le rendement en impuretés des CAF isolés, gardez les tampons au froid, respectez le temps d’incubation avec des billes et tirez jusqu’à quatre tumeurs par colonne avant l’étape finale d’enrichissement. Les CAF isolés peuvent être utilisés pour dépister plusieurs nanomédérapeutiques candidats en termes de liaison, d’absorption et d’efficacité pharmacologique avant de procéder à des expériences précliniques in vivo.
L’isolement CAF nous a permis de tester si des nanoparticules peuvent être utilisées pour cibler le microenvironnement tumoral. Ouvrant ainsi la voie à de nouvelles thérapies ciblées travaillant en synergie avec la chimiothérapie.
